ExpressÃo de uma quitinase de Chromobacterium Violaceum em Pichia Pastoris: purificaÃÃo e caracterizaÃÃo parcial da proteÃna recombinante / Expression of a chitinase from Chromobacterium Violaceum in Pichia pastoris: purification and partial characterization of recombinant protein

AUTOR(ES)

CÃcero Silvano Teixeira

FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

28/02/2011

RESUMO

A utilizaÃÃo de microrganismos como sistemas heterÃlogos de expressÃo de proteÃnas tem se mostrado uma estratÃgia alternativa e/ou complementar aos passos tradicionais utilizados no processo de purificaÃÃo de proteÃnas. Diante deste contexto, quitinases (EC 3.2.1.14), enzimas hidrolÃticas capazes de degradar quitina, tÃm sido expressas em diferentes sistemas heterÃlogos, incluindo bactÃrias e leveduras. Quitina à um polÃmero linear composto de resÃduos de N-acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc), sendo um importante constituinte estrutural da carapaÃa de crustÃceos e membrana peritrÃfica de insetos e, ainda, da parede celular de fungos. Este trabalho teve por objetivo expressar uma quitinase, codificada pela ORF cv3316, de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 na levedura metilotrÃfica Pichia pastoris, estirpes GS115 e KM71H, alÃm de purificar e caracterizar a proteÃna recombinante (rCHI3316). A estirpe GS115, portando a construÃÃo (pPICZαA-CV3316), foi selecionada para os experimentos posteriores, pois apresentou um maior nÃvel de expressÃo quando comparada à cepa KM71H. Cromatografia de afinidade em coluna de nÃquel imobilizado foi utilizada para purificar a quitinase recombinante (rCHI3316), que foi eluÃda como um Ãnico pico com imidazol 0,04 M. A proteÃna purificada se mostrou homogÃnea quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida 15% em presenÃa de SDS e -mercaptoetanol (SDS-PAGE). Nessas condiÃÃes, uma Ãnica banda com massa molecular aparente de aproximadamente 87 kDa foi observada. A quitinase rCHI3316 de C. violaceum foi expressa de forma solÃvel utilizando o sistema de expressÃo P. pastoris e, alÃm disso, sua purificaÃÃo foi realizada de forma satisfatÃria. O conteÃdo de estrutura secundÃria foi estimado por espectroscopia de dicroÃsmo circular (CD), com a proteÃna submetida a diferentes temperaturas (10-90 ÂC). Na temperatura de 24 ÂC, o espectro de CD revelou a predominÃncia do conteÃdo de hÃlice alfa (38%), folha beta (26 %) e estrutura randÃmica (37%). Entre as temperaturas de 10-50 ÂC, rCHI3316 exibiu um espectro caracterÃstico de folha beta. A partir de 60 ÂC atà 90 ÂC, rCHI3316 adquiriu uma conformaÃÃo caracterÃstica de hÃlice alfa. A temperatura mÃdia para essa transiÃÃo conformacional foi calculada como sendo 59,6  1,21 ÂC. Experimentos de espectroscopia de fluorescÃncia, com excitaÃÃo a 280 e 290 nm, produziram espectros de emissÃo com comprimentos de onda mÃximos iguais a 339 e 342 nm, respectivamente. Esses valores sÃo caracterÃsticos de resÃduos de triptofano parcialmente expostos ao solvente. Atividade quitinolÃtica contra vÃrios substratos e dependÃncia de pH da atividade enzimÃtica da proteÃna pura foram avaliados. A rCHI3316 exibiu atividade hidrolÃtica sobre os substratos quitina coloidal (1.189,40 U/mgP), 4-nitrofenil N-Nâ-diacetil-β-D-quitobiosÃdeo (30.411,0 U/mgP) e 4-nitrofenil N-Nâ-Nââ-triacetilquitotriose (13.150,0 U/mgP); entretanto, nenhuma atividade enzimÃtica da rCHI3316 foi detectada frente a 4-nitofenil N-acetil-β-D-glucosaminÃdeo. A enzima exibiu atividade quitinolÃtica Ãtima (100%) em pH 5,0; quando quitina coloidal foi utilizada como substrato. Em adiÃÃo, a atividade antifÃngica contra fungos fitopatogÃnicos, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Penicillium herquei foi investigada. rCHI3316 nÃo inibiu a germinaÃÃo e o crescimento micelial dos esporos dos fungos testados, na concentraÃÃo de 0,63 mgP.ml-1. Estudos subseqÃentes deverÃo ser realizados na intenÃÃo de descobrir potenciais aplicaÃÃes desta proteÃna como uma ferramenta biolÃgica no controle de outros fungos fitopatogÃnicos bem como insetos considerados pragas.

ASSUNTO(S)

biofisica molecular rchi3316 expressÃo heterÃloga chromobacterium violaceum pichia pastoris dicroÃsmo circular fungos fitopatogÃnicos c. violaceum p. pastoris chitinase heterologous expression fungos fitopatogÃnicos quitinase - isolamento e purificaÃÃo bioquÃmica chromobacterium

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