STUDY OF CHROMATOGRAPHYC METHODS FOR THE POTENCY EVALUATION OF FILGRASTIM AND CORRELATION WITH BIOLOGICAL ASSAY / ESTUDO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA AVALIAÇÃO DE POTÊNCIA DE FILGRASTIMA E CORRELAÇÃO COM ENSAIO BIOLÓGICO

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

O fator estimulador da colônia de granulócitos humanos é uma citocina hematopoiética que estimula e regula a proliferação e diferenciação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. O hormônio recombinante (rhG-CSF) sob a forma nãoglicosilada, filgrastima, é usado para o tratamento de neutropenias. Realizou-se a identificação de filgrastima em produtos farmacêuticos por eletroforese, transferência e detecção com anticorpos específicos, demonstrando-se banda única na região de peso molecular de, aproximadamente, 18,8 kDa. Avaliou-se a atividade pelo ensaio biológico da neutropenia em camundongos da linhagem BALB/c, pré-tratados com ifosfamida. Desenvolveu-se e validou-se o método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), utilizando coluna Júpiter C4 300 Å (250 mm x 4,6 mm, i.d.), mantida a temperatura ambiente. A fase móvel A foi constituída de água/acetonitrila (90:10, V/V)/ 0,1% ácido trifluoroacético e a fase móvel B de água/acetonitrila (20:80, V/V)/ 0,1% ácido trifluoroacético, eluída em gradiente na vazão de 0,5 mL/min com detecção no ultravioleta a 280 nm. A análise cromatográfica viabilizou a separação da filgrastima no tempo de retenção de 31,9 min, sendo linear na faixa de concentração de 10 300 μg/mL. Avaliaram-se os parâmetros de precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estudou-se também a especificidade, através da determinação da pureza do pico da Substância biológica de referência de rhG-CSF, submetida à degradação sob condições oxidativas. O método proposto foi utilizado para análise de filgrastima em produtos farmacêuticos, determinando-se as formas de sulfóxidos e desamidados. Paralelamente, efetuaram-se avaliações de potência por cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM), determinando as formas diméricas e de alta massa molecular. Amostras de produtos farmacêuticos foram submetidas a condições de agregação e degradação e, então, avaliadas pelo bioensaio da neutropenia em 5 camundongos, obtendo-se atividades biológicas de 14,60%, 13,47% e 15,63%, para os dímeros, substâncias de alta massa molecular e sulfóxidos/desamidados, respectivamente. Estudou-se a correlação entre métodos e demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias 2,04% menor por CL-FR, e significativa de 4,03% menor por CL-EM, em relação ao ensaio biológico. Devido à reduzida bioatividade das formas alteradas, conclui-se sugerindo a adoção do método por CL-EM para a avaliação de potência de filgrastima, em combinação com CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

ASSUNTO(S)

farmacia filgrastim cromatografia líquida validation neutropenia filgrastima fator estimulador da colônia de granulócitos humanos recombinante validação recombinant human granulocyte colony-stimulating factor liquid chromatography neutropenia

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