Purificação, caracterização e aplicação de B-glicosidase de cotilédones de soja

AUTOR(ES)

Rafael Fernandes Santos

FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

19/02/2010

RESUMO

A b-glicosidase (b-D-glicosídeo glicohidrolase, EC 3.2.1.21) é uma enzima capaz de clivar as ligações b-glicosídicas de di e/ou oligosacarídeos liberando glicose e uma aglicona. Esta enzima possui inúmeras funções endógenas nos vegetais, podendo ser utilizadas na hidrólise de isoflavonas glicosídicas (genistina, daidzina e glicitina) em agliconas (genisteína, daidzeína e gliciteína) que apresentam ação benéfica na saúde humana, atuando no controle e prevenção de doenças crônicas. O objetivo deste trabalho foi purificar b-glicosidase de cotilédones de soja, caracterizá-la e aplicá-la em farinha de soja integral. A b-glicosidase foi extraída de farinha de cotilédones com tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 6,6, na proporção de 1:10 (p/v), com posterior acidificação com HCl 0,1 N até pH 5,0 para obtenção do extrato bruto que foi fracionado com (NH4)2SO4 de 0−40% e 40−85%. Os precipitados, ressuspensos em tampão fosfato citrato 50 mM, pH 5,0 e os sobrenadantes foram dialisados no mesmo tampão. A fração com maior atividade de b-glicosidase (P40 85) foi concentrada por ultrafiltração e aplicada em coluna de troca iônica com CM Sephadex C-50, eluída por gradiente de NaCl 0–1 M em tampão fosfato-citrato, onde foram separadas quatro frações protéicas (F1, F2, F3, e F4). A fração F4, com maior atividade de b-glicosidase, foi aplicada em coluna de filtração em gel com Sephadex G-100, sendo separadas em três frações protéicas (F41, F42 e F43). O processo de purificação foi acompanhado por meio de eletroforese nativa em gel de poliacrilamida. A b-glicosidase purificada foi caracterizada em relação a sua massa molecular e o efeito de íons metálicos e compostos orgânicos sobre sua atividade. A b-glicosidase purificada e parcialmente purificada foi aplicada em farinha de soja integral sob diferentes condições de tratamentos utilizando um planejamento experimental com esquema fatorial 22 com dois níveis e triplicata no ponto central onde foi avaliada a influência das variáveis tempo de incubação e concentração da enzima na liberação de glicose. A eletroforese nativa revelou uma única banda de proteína na fração F42, demonstrando que o processo de purificação de b-glicosidase foi eficiente. A fração F42 apresentou massa molecular de 53 kDa por filtração em gel e 33 kDa por eletroforese em condições desnaturantes. A atividade de b-glicosidase foi inibida por HgCl2 1 mM, glucona-d-lactona 10 mM e glicose 150 mM em 84, 94 e 84%, respectivamente. O MnCl2 10 mM aumentou a atividade da enzima em 63%. A aplicação da b-glicosidase em farinha de soja integral mostrou-se eficiente na liberação de glicose e consequentemente na liberação de isoflavonas agliconas, sendo os melhores resultados obtidos com 6 horas de incubação, independente da concentração de enzima utilizada. A b-glicosidase purificada mostrou-se mais ativa na liberação de glicose em relação à parcialmente purificada.

ASSUNTO(S)

enzimas - aplicações industriais alimentos - biotecnologia isoflavonas farinha de soja enzymes industrial applications food biotechnology soybean flour

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