Estudo das bases mecanísticas da diferenciação neuronal mediada pela atividade de Ca2+ através dos receptores purinérgicos e colinérgicos / Study of mechanistic bases of neuronal differentiation mediated by Ca2+ activity through purinergic and cholinergic receptors

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

Muitos subtipos de receptores são ativados pelo mesmo ligante, mas estão acoplados a diferentes mensageiros secundários podendo produzir sinalização divergente em uma célula, enquanto receptores ativados por diferentes ligantes, mas que compartilham o mesmo mensageiro secundário, podem produzir sinalização convergente. Para examinar as bases mecanísticas que influenciam a proliferação e a diferenciação celular determinamos as funções de liberação intracelular de Ca2+ e a excitabilidade celular mediada pelos receptores purinérgicos e colinérgicos utilizando imageamento de cálcio por microscopia confocal. Para tanto, caracterizamos a participação dos subtipos P2X1-7 e P2Y1,2,4,6 de receptores purinérgicos aos níveis dos transcritos de mRNA e de expressão protéica, assim como pela atividade de induzir os transientes de [Ca2+]i, aumento na concentração livre de cálcio intracelular, durante a diferenciação neuronal de células P19 de carcinoma embrionário, que foram utilizadas como modelo in vitro para o desenvolvimento neuronal precoce. Em células embriônicas os receptores P2Y1,2, P2X4 ou os heteromultímeros de P2X com farmacologia semelhante ao do receptor P2X4 foram os responsáveis pelos transientes de [Ca2+]i induzidos pelo ATP e seus análogos. Ao término da diferenciação neuronal, os receptores P2Y2,6 e P2X2 foram os principais mediadores das respostas de [Ca2+]i. Obtivemos evidências do envolvimento destes receptores na indução da proliferação tanto de células embriônicas como de progenitores neuronais, por ensaios de incorporação de BrdU, e da indução da diferenciação neuronal das células progenitoras, na presença de vários agonistas e antagonistas de receptores purinérgicos. Como resultado desses estudos, a regulação da proliferação e diferenciação celular foi principalmente devida aos subtipos de receptores P2Y1 e P2Y2, já que estes efeitos foram eliminados após a depleção dos depósitos intracelulares de cálcio e pela demonstração de que estes eram os possíveis receptores funcionais. Entre os receptores colinérgicos, fornecemos evidências para a expressão de receptores nicotínicos (nAChRs) e muscarínicos (mAChRs) funcionais durante a diferenciação de células P19. Detectamos a expressão e a atividade dos subtipos de nAChRs formados pelos subtipos α2-α7, β2, β4 e M1-M3 e M5 de mAChRs durante a diferenciação neuronal. As respostas de [Ca2+]i induzidas pelos agonistas dos nAChRs foram observadas em células P19 embriônicas e neuronais. As respostas de [Ca2+]i mediadas pelos receptores muscarínicos, em níveis próximos aos basais em células embriônicas, aumentaram durante a diferenciação. As elevações na [Ca2+]i induzidas pelos nAChRs em células indiferenciadas foram devidas ao influxo de Ca2+ do meio extracelular. Em células diferenciadas em neurônios, os aumentos de transientes de [Ca2+]i induzidos pelos nAChRs foram parcialmente inibidas após o pré-tratamento das células com a rianodina, enquanto as respostas de [Ca2+]i mediadas pelos mAChR não foram afetadas na presença deste composto, sugerindo uma contribuição da liberação de Ca2+ a partir dos depósitos de Ca2+ sensíveis à rianodina para as elevações mediadas pelos nAChRs. Demonstramos também, que a nicotina, agindo através dos nAChRs, inibiu a proliferação em células embriônicas, porém, a induziu em células progenitoras neuronais pela mobilização de Ca2+ dos depósitos intracelulares. A muscarina induziu em células embriônicas o aumento na proliferação via mAChRs acoplados às proteínas Gαq/11, e promoveu a diferenciação neuronal via M2 mAChRs em células precursoras neuronais. Estes dados sugeriram que a acetilcolina agindo via mAChR funciona como um mitógeno que ativa as proteínas quinases de trifosfato de inositol (IP3) e que poderia estar envolvida na síntese de DNA durante os estágios iniciais da neurogênese. Nós ainda provemos evidências que as oscilações de [Ca2+]i são características para cada estágio da diferenciação e são iniciadas pela liberação de Ca2+ mediada pelo IP3. As análises da determinação do fenótipo neuronal na presença de vários inibidores da transdução do sinal induzido pelo cálcio residem na liberação de Ca2+ induzida pelo IP3 é necessária para o progresso da diferenciação neuronal. Assim, os sinais espontâneos de [Ca2+]i são propriedades intrínsecas das células em diferenciação. A modulação de sua freqüência e amplitudes especifica a aquisição de um fenótipo de célula neuronal.

ASSUNTO(S)

spontaneous calcium events cell proliferation sinalização de cálcio calcium signaling receptores colinérgicos receptores purinérgicos cholinergic receptors diferenciação neuronal purinergic receptors eventos espontâneos de cálcio proliferação celular neuronal differentiation

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