Purificação e caracterização molecular da lisina-cetoglutarato redustase de endospermas de milho (Zea mays L.)

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

1989

RESUMO

Neste trabalho, foram determinadas algumas características da enzima lisina-cetoglutarato redutase (EC1.5.1.8) de endospermas normais e opaco-2 da linhagem homozigota de milho - L 1038. A exemplo do que ocorre em mamíferos, esta enzima deve participar do primeiro passo do catabolismo de lisina e catalisa a reação:Lisina + alfa-cetoglucarato + NADPH ->sacaropina + NADP+Durante o desenvolvimento do endosperma, a atividade de LKR mostrou variações significativas em ambos os genótipos, as quais, parecem ser coincidentes com a sua síntese, sendo que, ela aumentou logo no início do desenvolvimento da semente, encontrou um pico aos 20-25 dias após a polinização e decresceu, em seguida, em direção à maturidade da semente. O padrão de atividade, no endosperma opaco-2, é drasticamente diminuído em relação ao normal, chegando a ser três vezes menor que este nos estágios intermediários do desenvolvimento do endosperma. Ao mesmo tempo, quando extratos de endospermas normais e mutantes opaco-2 foram submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida (sob condições não-denaturantes), e a seguir, a atividade de LKR foi revelada em gel, uma banda correspondente à atividade da enzima, foi possível de ser visualizada somente no material normal. Estes resultados indicam que a enzima LKR está sob controle do gene opaco-2.Cerca de 3.000 endospermas da versão normal, no período de maior atividade de LKR, foram utilizados para a purificação da enzima através de uma seqüência de passos de fracionamento em sulfato de amônio, ultracentrifugação e cromatografias de troca iônica e afinidade. A preparação mais pura obtida da cromatografia de afinidade foi enriquecida 275 vezes e tinha uma atividade específica de "414 nmoles de NADPH.min-1.mg de proteína-1. A enzima deve ser uma monômero de Mr 130.000 a 160.000, conforme determinado por filtração em gel Sephadex G-200, ultracentrifugação em gradientes de sacarose e eletroforese em géis de poliacrilamida. A banda mais intensa de Mr 134.000, proveniente da eletroforese sob condições denaturantes da enzima purificada, foi utilizada para a preparação de anticorpos policlonais, em coelhos New Zealand. Os experimentos de " Western blot, utilizando-se estes anticorpos, foram realizados com os extratos provenientes dos diferentes passos da purificação da enzima, resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida (sob condições denaturantes). Os resultados demonstraram o reconhecimento, por parte destes anticorpos, de uma única banda de Mr 130.000 nos extratos purificados. Entretanto, nos extratos da centrifugação a 3.000 X g ou a 22.000 X g e naqueles fracionados com sulfato de amônio, além desta banda, uma segunda banda de menor peso molecular (Mr = 80.000), foi também reconhecida por estes anticorpos. A origem desta banda, até o momento nos é desconhecida, desde que todos os resultados obtidos, neste trabalho, indicam a existência de uma única forma da enzima na fração solúvel de endospermas normais e mutantes opaco-2. A enzima de milho tem propriedades bastante similares às enzimas de fígado e placenta humanos, tais como: requerimento pelo cofator NADPH, pH ótimo, termoestabilidade e inibição pelo produto ? sacaropina. A cinética da enzima mostrou ser bastante complexa para ambos substratos. Os valores de Km encontrados para lisina foram de 8,7 e 4,1mM, respectivamente para as versões normal e opaco-2

ASSUNTO(S)

milho

ACESSO AO ARTIGO

Documentos Relacionados