Purificação e caracterização dos inibidores de amilase em milho (Zea mays L.) visando controle de fusarium verticillioides

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2003

RESUMO

O milho (Zea mays L.) é uma cultura de interesse mundial envolvendo produção de 583 milhões de toneladas, sendo que o Brasil produz aproximadamente 7% do total. Devido as propriedades nutricionais, o milho está sujeito a diversos predadores com ênfase a insetos e fungos micotoxigênicos, destacando-se Fusarium verticillioides Niremberg (F. moniliforme Sheldon), por ser contaminante predominante de distribuição mundial, produtor de fumonisina na micoflora. Considerando que o controle de fungos em milho seja difícil, pesquisas estratégicas tem como alvo o estudo de compostos envolvidos nos mecanismos naturais de defesa das plantas, citando-se os inibidores de amilase (IA). Esta pesquisa contribuiu com o estudo dos mecanismos naturais de defesa com ênfase a inibidores contra amilase de F. verticillioides, assim como de insetos predadores relevantes na agricultura, visando o melhoramento genético do milho. A triagem de inibidores de amilase (IA) contra amilase de F. verticillioides foi realizada em 37 híbridos. O nível de IA variou de 5,5 a 16,0 unidades inibidoras de amilase (UIA/g) por grama de milho nos híbridos MASTER e AG5011, respectivamente. O híbrido com maior atividade inibidora de amilase foi utilizado na purificação da nova proteína por precipitação fracionada com (NH4)2SO4, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-75), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em coluna de Superose HR 10/30 e troca aniônica em CLAE, obtendo 20,7 vezes de purificação. A massa molecular aparente de 23,8 kDa foi determinada em SDS-PAGE sob condições redutoras com pI ácido de 5,4, diferindo de outros inibidores descritos em milho (14 e 22 kDa). O IA apresentou amplo espectro de atividade, inibindo amilase salivar e pancreática humana, de fungos como F. verticillioides e A. flavus, de insetos como A. obtectus, Z. subfasciatus, T. castaneum e S. cerealella. Fusarium spp. foi o principal contaminante do milho (81,1% das amostras) com contagem entre 1,5 x 102 a 2,4 x 106 ufc/g de milho, e fumonisina foi detectada em 21 híbridos com concentrações de 0,05 a 2,67 µg de FB/g de milho. No entanto, a correlação entre o nível de IA nos grãos de milho com a presença de Fusarium spp. e fumonisina nas condições experimentais avaliadas não foi significativa. Outro IA estudado apresentou alta hidrofobicidade com massa molecular de 19,7 kDa, foi purificado de milho procedendo extração com etanol a 95%, seguida de cromatografia de troca iônica. O IA ativo contra Fusarium verticillioides apresentou ponto isoelétrico de 3,6, estabilidade em ampla variação de pH e temperatura, mantendo 47,6% da atividade após tratamento a 94°C por 60 min. O IA purificado apresentou alto conteúdo de valina, leucina, glicina, alanina e glutamina/ácido glutâmico, com destaque especial ao teor de valina (41,2%). O inibidor não apresentou carboidrato na estrutura molecular e requereu 30 min de pré-incubação com amilase de F. verticillioides, para estabilizar o complexo enzima-inibidor. O pH ótimo de interação foi 6,5 e caracterizou-se com amplo espectro de ação, incluindo desde atividade sobre amilase salivar humana, pancreática de porco, F. verticillioides, a insetos de interesse agronômico (Acanthoscelides obtectus, Zabrotes subfasciatus, Sitophilus zeamais e Prostephanus truncatus). A nova proteína hidrofóbica demonstrou potencial de utilidade como marcadores moleculares de resistência fúngica, uma vez que também inibe a germinação de conídios de F. verticillioides, constituindo em alternativa promissora para minimizar a produção de fumonisina em milho. A comparação entre a microbiota fúngica, concentração de fumonisina e nível de IA contra amilase de F. verticillioides entre os 21 híbridos do grupo precoce e 16 de ciclo super precoce, não foi estatísticamente significativa (P >0,05), sugerindo que maior ênfase deve ser dada às características inerentes do híbrido conforme interesse particular dos produtores, durante a escolha do ciclo a ser cultivado. Em suma, a atividade inibidora não se restringiu apenas a fungos micotoxigênicos relevantes no milho, mas também inibiu enzima de insetos de interesse agronômico, gerando novas perspectivas no estudo desta proteína contra resistência a predadores/fitopatógenos. I.e., desenvolvimento de plantas biotecnologicamente melhoradas, com a vantagem de não inibir as amilases de origem humana, aliada a baixa atividade sobre amilase de milho, arroz e cevada.

ASSUNTO(S)

milho corn fungal toxins food - analysis fusarium alimentos - análise fusario micotoxinas

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