Proteção induzida pela fração de alta massa molecular de Paracoccidioides brasiliensis em camundongos BALB/c

Wander Rogerio Pavanelli

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença infecciosa, granulomatosa, causada por um fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb), que cresce, no hospedeiro ou em cultivo a 37ºC, sob a forma de levedura ou como micélio (filamentoso) a 25ºC. É uma doença restrita à América Latina e com grandes áreas endêmicas no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina [1]. Propágulos fúngicos aéreos constituídos de hifas iniciam a infecção com focos nos pulmões, seguido de disseminação linfática ou hematogênica para os linfonodos, fígado, baço, pele e mucosa [3-4]. Nos pulmões ou nódulos linfáticos os granulomas podem permanecer dormentes por anos ou progredir para desencadear uma doença, dependendo da resposta imune do hospedeiro. Em virtude do aumento na proporção de doenças fúngicas como a PCM, sobretudo acarretada pela reativação dos focos dormentes, convém à utilização de imunização terapêutica como tentativa para eliminar os organismos dormentes ou propriamente extinguir a infecção [4], especialmente em doenças cujo tratamento é longo, como o caso da PCM, podendo em alguns casos provocar lesões nefrotóxicas e hepatotóxicas. O maior desafio em experimentos com vacinação contra fungos, de todos os tempos, tem sido identificar substâncias ou partículas inertes fúngicas como proteínas ou carboidratos, que possam ser utilizadas como veículo no processo imunoterápico. Uma das metas e também uma das dificuldades para geração de uma vacina, é a identificação de uma partícula que possa promover uma resposta imune adequada e efetiva. Em se tratando da aracoccidioidomicose, também se tem almejado criteriosamente uma proteção, que no decorrer de alguns estudos está correlacionada com a presença de uma exuberante resposta imune mediada por células. Dados preliminares indicam que imunizações estimulando a liberação de INF-? e injeções de gp43 possam reduzir a concentração do P. brasiliensis nos pulmões de camundongos inoculados intratraquealmente e diminuir a gravidade da inflamação nos pulmões [3] Embora diversos estudos tenham sido feito na intenção de obter uma substância que possa ativar principalmente a resposta imune celular protetora, pouco avanços tem sido observados. No presente trabalho foi introduzido uma nova fração de P. brasiliensis de Alta Massa Molecular (high Mass Molecular)-hMM, com os seguintes objetivos específicos: a) Determinar nível sérico de gp43 solúvel no decorrer da infecção experimental em camundongos imunizados e não imunizados com a fração de hMM. b) Quantificar a presença de células de P. brasiliensis em tecido de camundongos, imunizados e não imunizados com a fração de hMM, utilizando a técnica de CFU-Unidades Formadoras de Colônias. c) Analisar a Reação de Hipersensibilidade Tardia.-DTH, usando como estímulo a fração de hMM. d) Analisar as características histopatológicas dos tecidos (Pulmão, Fígado) com relação às lesões granulomatosas no decurso da infecção experimental em camundongos BALB/c, previamente imunizados ou não com a fração de hMM. e) Determinar os níveis séricos de IgG anti- hMM, IgG anti-gp43 e de IgG anti-ExoAg, no processo de imunização com a fração de hMM, em camundongos BALB/c. Foi utilizado P. brasiliensis (Pb 18) na fase leveduriforme e o Ag CFA obtido de acordo com Camargo [2], modificado pela adição de inibidores de proteases (PMSF). Esta amostra foi fracionada em coluna de Sephadex G200, obtendo-se a fração de hMM, de acordo com (Dissertação de Mestrado-Marquez et al, 2003). Foram utilizados camundongos fêmeas BALB/c divididos em 4 grupos: a) Controle, b)Infectado, c) Imunizado com 50µg da fração de hMM (F-50) e infectados, d) Imunizados com 100µg da fração de hMMc (F-100) e infectados. A análise dos níveis séricos de gp43 solúvel, de IgG anti-hMMc, IgG anti-gp43, IgG anti-ExoAg foi realizada por ELISA, Contagem de Unidades Formadoras de Colônias-CFU, com amostras de pulmão e fígado, Reação de Hipersensibilidade Tardia-DTH com a fração de hMM e Análise Histopatológica, foram realizadas após 28 e 56 dias da infecção. Os resultados demonstraram níveis de antígenos solúveis menores (p<0,001) no período de 28 dias, em relação ao grupo infectado, já para o período de 56 dias, somente os animais imunizados com F-100 da fração de hMM, é que apresentam diferenças significativas (p<0,001). Quanto aos níveis de anticorpos IgG anti-ExoAg e anti-gp43, podemos observar que ambos os grupos F-50 e F-100 apresentaram níveis elevados de anticorpos (p<0,001), em relação aos demais, isto para 28 dias, e 56 dias (p<0,001, p<0,01), respectivamente. Contudo os níveis de IgG anti-hMMc, divergiram entre os grupos F-50 e F-100, visto que em 28 dias somente o grupo F-50, apresentou níveis significativos (p<0,001) se comparado ao grupo infectado. Já no período de 56 dias, somente o grupo F-100, mostrou valores significantes (p<0,05). Para ambos os órgãos analisados pelo CFU (pulmão e fígado), ambos os grupos F-50 e F-100 da fração hMM, apresentaram valores estatisticamente significantes (P<0,001) (pulmão-28 dias) e p<0,05 (pulmão-56 dias), sendo que para fígado o grupo F-50 apresentou (p<0,05) e F-100 (p<0,01), 28 e 56 dias, respectivamente. A reposta imune celular específica mensurada in vivo pelo DTH, foi desenvolvida eficientemente pelos animais que foram previamente imunizados, em ambos os períodos de 28 e 56 dias e grupos F-50 e F-100. A análise das lesões granulomatosas evidenciou, em animais imunizados, um grau de compactação e organização maior, sem a disseminação do fungo para outros órgãos, quando comparado aos animais não imunizados.

Proteção induzida pela fração de alta massa molecular de Paracoccidioides brasiliensis em camundongos BALB/c

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