Production of beta-1, 3-glucanase from Cellulosimicrobium cellulans 191 for l enzimatic lysis of the yeast Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus and the production of beta-galactosidade / Produção de B-1, 3-glucanase de Cellulosimicrobium cellulans 191 para lise enzimatica da levedura Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus e obtenção de B-galactosidade

Giselle de Arruda Rodrigues

A enzima ß-1,3-glucanase da bactéria Cellulosimicrobium cellulans 191 é capaz de lisar a parede celular de diversas leveduras dentre elas as linhagens de Kluyveromyces sp., produtoras da enzima intracelular ß-galactosidase. Este trabalho visou a produção de ß-1,3-glucanase lítica de Cellulosimicrobium cellulans 191 para obtenção das preparações enzimáticas bruta concentrada e purificada com alta atividade lítica para aplicação na obtenção de protoplastos de leveduras e lise das células de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus para extração de b-galactosidase. A ß-1,3-glucanase extracelular foi produzida pela bactéria Cellulosimicrobium cellulans 191 em meio otimizado composto de 10g/L de parede celular de levedura, 2,0g/L de (NH4)2SO4; 0,2g/L de MgSO4.7H2O em tampão fosfato 0,2M, pH 7,5 como descrito por SCOTT e SCHEKMAN (1980) e modificado por SOARES (2002). Foi obtida maior produção da ß-1,3-glucanase na fermentação do microrganismo em frascos aletados a 30ºC, 200rpm por 24 horas do que em fermentador contendo o mesmo meio a 30ºC, 1,5vvm por 24 horas, obtendo-se 0,724 e 0,351U/mL, respectivamente. Os sobrenadantes dos meios fermentados em frascos agitados e em fermentador de 5L apresentaram atividade de 0,120 e 0,064U/mL de protease, respectivamente. Foi estudada a influência dos compostos sacarose (10mM), lactose (10mM), maltose (10mM), glicerol (10mM), gelatina (125mg/mL), albumina de ovo (125mg/mL), sulfato de amônio (10mM), EDTA (10mM), b-mercaptoetanol (10mM) e cisteína (10mM) na preservação da atividade de ß-1,3-glucanase da preparação enzimática bruta a 45ºC, 50ºC e 55ºC, no entanto, nenhum dos compostos testados aumentou a estabilidade da enzima. Foi testada a concentração da preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase por liofilização, ultrafiltração, fracionamento com sulfato de amônio, pela remoção de água com carboximetilcelulose (CMC) e precipitação com os solventes orgânicos acetona e etanol. A concentração da preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase utilizando-se sacos de diálise e CMC em pó para a adsorção da água mostrou-se como o método mais eficiente, sendo que a enzima foi concentrada 6,38 vezes com manutenção de 96% da atividade inicial. A preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase foi purificada aproximadamente 2 vezes por fracionamento com sulfato de amônio 30% de saturação. A ß-1,3-glucanase da preparação enzimática bruta foi purificada aproximadamente 6,66 vezes através de fracionamento com sulfato de amônio a 30% de saturação, dessalinização em coluna de exclusão Sephadex PD10 e cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sephacelè, com rendimento de 18%. Dentre as linhagens das leveduras Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Kluyveromyces drosophilarium, Kluyveromyces marxianus NRRL7571, Kluyveromyces marxianus NRRL1196, a primeira foi selecionada como maior produtora da enzima b-galactosidase. As preparações enzimáticas bruta concentrada e purificada de ß-1,3-glucanase apresentaram capacidade de lisar as células de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus a 37ºC. Para a formação de protoplastos foi utilizado 0,1U de ß-1,3-glucanase por mL de suspensão de levedura equivalente a 1,3mg de massa celular seca, durante 1 hora a 37ºC. A extração da ß-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi testada pelos métodos químico (solventes orgânicos), enzimático (ß-1,3-glucanase) e físico (ultrasonicação). O método de pré-tratamento enzimático e posterior aplicação de ultrasonicação apresentou melhores resultados seguido pelos métodos de permeabilização com etanol 50%, b-1,3-glucanase purificada, ultrasonicação, permeabilização com tolueno 20% e ß-1,3-glucanase bruta, obtendo-se, respectivamente, atividades de ß-galactosidade (massa celular seca) iguais a 25,13U/mg/min; 14,00U/mg/min; 13,11U/mg/min; 10,95U/mg/min; 10,75U/mg/min e 7,25U/mg/min utilizando-se lactose como substrato. A b-galactosidase bruta apresentou atividade ótima em pH 7,0 e 32ºC e mostrou-se estável na faixa de 30 a 35ºC após 3 horas em pH 7,0 e na faixa de pH entre 6,5 e 7,5 após 3 horas a 35ºC. A b-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi purificada 2,3 vezes após fracionamento com sulfato de amônio a 60% de saturação, diálise e cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sephacelè, com rendimento de 31%. As preparações enzimáticas bruta e purificada da ß-glucanase lítica da bactéria Cellulosimicrobium cellulans podem ser utilizadas na obtenção de protoplastos de leveduras e extração de enzimas intracelulares de leveduras

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