Produção de uma fração concentrada em alfa-amilase salivar humana (HSA) como alvo para descoberta de novos inibidores e fracionamento do extrato hidroalcóolico da casca de Pouteria sp

Neire Moura de Gouveia

Capítulo II: As alfa-amilases (α-1,4-D-glicano-4-glicanohidrolases, EC 3.2.1.1) são enzimas responsáveis pela digestão de carboidratos e são encontradas na saliva e no suco pancreático. As seqüências primárias das alfa-amilases salivar (HSA) e pancreática (HPA) exibem 99% de similaridade estrutural o que sugere que a HSA pode ser um alvo de estudos experimentais de inibição da digestão de carboidratos uma vez que potenciais inibidores teriam comportamentos similares para HPA e HSA. Desse modo, pelas vantagens da coleta não invasiva da saliva em relação ao suco pancreático obteve-se no presente estudo, uma fração denominada HSA-CTI. Com esta preparação verificou-se o efeito inibitório sobre a atividade enzimática da HSA-CTI a partir de preparações do extrato bruto da casca de Pouteria sp. Amostras de saliva foram congeladas por 48h, centrifugadas e o sobrenadante foi sujeito a cromatografia de troca iônica em coluna de Q-Sepharose equilibrada com 25mM de tampão Tris-HCl, pH 8,0 contendo 5mM de EDTA e 5mM de EGTA. A coluna foi lavada com o mesmo tampão de equilíbrio e eluída com um gradiente de NaCl (0-1M). Realizou-se dosagem protéica, SDS-PAGE, Western blotting e medida da atividade amilásica das frações obtidas. A fração HSA-CTI não interagiu com a coluna, sendo assim preparada por liofilização e armazenada em congelador até o momento dos ensaios de inibição. Preparações aquosa por maceração (EAP-C), aquosa por decocção (EADP-C), hidroalcóolica (EHP-C) e etanólica (EEP-C) do extrato da casca (10mg/mL em DMSO) foram testados pré-incubando por 10 e 30min a 37C com a fração HSA-CTI (1:10). Somente o polipeptídeo de 56kDa presente nesta fração exibiu reação cruzada com o anticorpo anti-HSA. O extrato EHP-C mostrou-se mais efetivo em inibir a atividade da HSA-CTI. Estes resultados indicam que a HSA-CTI pode ser obtida por um método rápido de cromatografia podendo ser utilizada em ensaios de inibição a partir de extratos vegetais. O extrato de Pouteria sp. apresentou como potencial candidato para estudos de fracionamento e descoberta de novas substâncias com atividade sobre estas enzimas. Capítulo III: Alguns estudos preliminares sobre extratos de plantas do gênero Pouteria (Sapotaceae) abordam seu potencial em inibir a alfa-amilase humana. Estes estudos de inibição podem implicar na descoberta de novas fontes para reduzir a hiperglicemia pós-prandial, importante no tratamento de diabetes e obesidade. Os componentes ativos de Pouteria são ainda na maioria desconhecidos, por isso, o presente estudo fracionou e investigou as substâncias presentes no extrato hidroalcóolico de Pouteria sp. com potencial inibitório sobre a alfa-amilase salivar in vitro. O extrato foi fracionado em coluna Sephadex-LH 20 equilibrada com metanol lavada com água, seguido por acetona. Todas as frações (POUN) foram testadas quanto ao potencial em inibir a alfa-amilase in vitro. As frações POUN2 e 3 foram injetadas em HPLC semipreparativo coluna Supelcosil LC-18 fase móvel metanol:água e analisadas em HPLC analítico coluna Supelcosil LC-18 fase móvel metanol:ácido acético 0,1%. A fração POUN7 apresentou padrões de inibição semelhantes ao extrato bruto inibindo 40,22% a atividade da amilase, além disso, representa 35% do extrato e é marcada por conter 48,81% de taninos em sua composição. As frações POUN2 e 3 inibiram 15% da atividade da amilase sendo constituídas por taninos. O extrato avaliado é rico em taninos concluindo que este é um potencial candidato a outros estudos devido a estas substâncias estarem envolvidos em diversas funções terapêuticas.

Produção de uma fração concentrada em alfa-amilase salivar humana (HSA) como alvo para descoberta de novos inibidores e fracionamento do extrato hidroalcóolico da casca de Pouteria sp

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