Clonagem e caracterização de genes E3 do sistema proteassomo-ubiquitina de Trypanosoma cruzi

AUTOR(ES)

Rozenn Le Bloas

DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

A metaciclogênese é provavelmente um processo regulado principalmente por alterações pós-transcricionais na expressão gênica. A proteólise mediada por ubiquitina pode ter um papel na reposição adaptativa das proteínas que levam o parasita às suas novas características morfológicas, fisiológicas e comportamentais. Pelo menos três enzimas são necessárias para a ubiquitinação: a enzima ativadora de ubiquitina (E1), a enzima conjugadora de ubiquitina (E2) e a ubiquitina ligase (E3). A E3 é geralmente considerada a enzima mais importante no controle da especificidade da marcação, já que ela é responsável por recrutar a proteína alvo e posicioná-la em ótima condição para a transferência da ubiquitina da E2. Para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na ubiquitinação no Trypanosoma cruzi, bem como para investigar seu possível papel durante a metaciclogênese, três E1, seis E2 e três E3 foram selecionadas para clonagem e caracterização. A metaciclogênese in vitro foi usada como modelo experimental para investigar a expressão destas enzimas. Os genes selecionados foram amplificados, clonados e expressos, e buscas bioinformáticas foram conduzidas para investigar a confiabilidade na anotação do genoma. As proteínas recombinantes foram usadas na produção de anticorpos policlonais, os quais foram empregados na caracterização da expressão e a localização destas enzimas durante a metaciclogênese. Além disso, os níveis de mRNA celular destes genes foram analisados por microarranjo e PCR em tempo real quantitativa. Adicionalmente foram efetuadas novas analises no genoma de T. cruzi, onde foram identificadas proteínas com domínios característicos das enzimas de ubiquitinação: 4 UBACT (E1); 14 UQ_con (E2); 10 HECT, 1 U-box e 35 zn-C3HC4 (E3). A análise da expressão revelou três tendências: aumento (uma E2, duas E3), redução (uma E1, uma E2) e sem variação (uma E1, três E2, uma E3) dos níveis de mRNA. Uma das E3 parece estar localizada no reservossomo e outra, no citóstomo. Em conjunto nossos resultados sugerem uma variedade de funções para estes genes, tais como degradação e transporte de proteínas.

ASSUNTO(S)

tripanossoma cruzi enzimas ciencias da saude gene expression cloning expressão gênica clonagem - (subd. geog.) medical sciences trypanosoma cruzi ciências médicas - dissertações enzymes

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