CaracterizaÃÃo parcial de uma Ca2+ -ATPase de larva de Pachymerus nucleorum (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae)

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

RESUMO GERAL - O babaÃu (Orbignya sp.) à uma palmeira que ocupa vastas Ãreas na regiÃo meio-norte do Brasil e desempenha um papel importante na subsistÃncia de milhares de habitantes desta regiÃo. Pachymerus nucleorum à um besouro da subfamÃlia Bruchinae, cujos representantes sÃo conhecidos como brocas de sementes, que causa muitos danos nas castanhas do babaÃu. As larvas deste animal penetram o coco de babaÃu logo apÃs sua eclosÃo, se desenvolvem alimentando-se das castanhas e somente emergem como adultos. Neste trabalho, estudamos a atividade enzimÃtica de hidrÃlise de ATP por uma fraÃÃo protÃica parcialmente purificada a partir das larvas de P. nucleorum sem o aparelho digestivo. As larvas foram extraÃdas dos cocos, lavadas e dissecadas para a retirada do aparelho digestivo. Seguimos o processo de purificaÃÃo a partir do restante do corpo e obtivemos a fraÃÃo precipitada (P3) com alta atividade ATPÃsica em presenÃa de cÃlcio, que foi caracterizada. A dosagem da atividade ATPÃsica foi realizada incubando-se amostras das fraÃÃes em meio de reaÃÃo tamponado contendo ATP 1 mM em concentraÃÃo final e os respectivos cÃtions metais em 4 mM. A fraÃÃo ATPase nÃo apresentou atividade significativa em 2 presenÃa de magnÃsio, cobalto, cobre, zinco, bÃrio, lÃtio ou ferro. Mesmo na ausÃncia de cÃtions (EDTA ou EGTA 5 mM) a atividade ATPÃsica à baixa, mas nÃo nula. Esta alta atividade Ca2+-ATPÃsica à inibida em presenÃa de cobalto, cobre, zinco, bÃrio ou ferro 4 mM. Hà uma sensÃvel inibiÃÃo (50%) pela presenÃa de magnÃsio 0,25 mM. A atividade ATPÃsica de P3, em presenÃa de ATP 1 mM, chega a 50% com CaCl2 0,5 mM, atingindo um platà com 2 mM. Com CaCl2 1 mM, a atividade ATPÃsica atinge 50% com 0,7 mM de ATP e o pico com 2 mM. Contudo, observa-se que hà um leve decaimento desta atividade com concentraÃÃes de ATP maiores que 2 mM. P3 nÃo utiliza pirofosfato nem nucleotÃdeos mono e difosfato para sua atividade, e a atividade Ca2+-GTPÃsica à apenas 20% da Ca2+-ATPÃsica. Esta fraÃÃo nÃo sofre inibiÃÃo significativa por vanadato (em concentraÃÃes menores que 200 ÂM), azida, Triton X-100 ou fluoreto de alumÃnio. Tal fraÃÃo à estÃvel a 4 ÂC por pelo menos 12 dias, porÃm seu congelamento (â20 ÂC) causa perda de mais da metade da atividade com 24 horas de estocagem. A atividade K+/EDTA-ATPÃsica à 50% da Ca2+-ATPÃsica, e nÃo ocorreu marcaÃÃo com anticorpos anti-miosinas II ou V. Neste trabalho obtivemos uma fraÃÃo enriquecida em atividade Ca2+-ATPÃsica a partir de larva de Pachymerus nucleorum sem aparelho digestivo, e caracterizamos parcialmente tal atividade. RESUMO - CAPÃTULO I Uma fraÃÃo com alta atividade Ca2+-ATPÃsica foi obtida a partir de larvas de Pachymerus nucleorum. As larvas foram dissecadas para a retirada do aparelho digestivo. O restante do corpo foi homogeneizado em tampÃo de extraÃÃo e centrifugado a 15000xg por 30 minutos. A fraÃÃo precipitada resultante P1 foi homogeneizada em tampÃo de ressuspensÃo contento Triton X-100 0,2%, incubada por 20 minutos em temperatura ambiente e centrifugada nas mesmas condiÃÃes. O precipitado, fraÃÃo P2, foi entÃo homogeneizado em tampÃo de ressuspensÃo contendo pirofosfato 50 mM. ApÃs incubaÃÃo por 20 minutos em temperatura ambiente seguiu-se centrifugaÃÃo a 40000xg por 30 minutos. A fraÃÃo precipitada P3 foi homogeneizado em tampÃo de ressuspensÃo e apresentou alta atividade Ca2+-ATPÃsica, que foi caracterizada. A fraÃÃo P3 nÃo apresentou atividade ATPÃsica significativa em presenÃa de alguns cÃtions: magnÃsio, cobalto, cobre, zinco, bÃrio, lÃtio ou ferro. A alta atividade Ca2+- ATPÃsica à inibida em presenÃa de cobalto, cobre, zinco, bÃrio ou ferro 4 mM. MagnÃsio 0,25 mM causa inibiÃÃo de 50% desta atividade. Em presenÃa de ATP 1 mM, a atividade ATPÃsica de P3 chega a 50% com CaCl2 0,5 mM, atingindo um 29 platà com 2 mM. Com CaCl2 1 mM, a atividade ATPÃsica atinge 50% com 0,7 mM de ATP e o pico com 2 mM. Contudo, observa-se que hà um leve decaimento desta atividade com concentraÃÃes de ATP maiores que 2 mM. P3 nÃo utiliza pirofosfato nem nucleotÃdeos mono e difosfato como substratos, e a atividade Ca2+-GTPÃsica à apenas 20% da Ca2+-ATPÃsica. Esta fraÃÃo nÃo sofre inibiÃÃo significativa por vanadato, em concentraÃÃes menores que 200 ÂM, azida, Triton X-100 ou fluoreto de alumÃnio. A atividade K+/EDTA-ATPÃsica à 50% da Ca2+- ATPÃsica, e nÃo ocorreu marcaÃÃo com anticorpos anti-miosinas II ou V. Neste trabalho obtivemos uma fraÃÃo enriquecida em atividade Ca2+-ATPÃsica a partir de larva de Pachymerus nucleorum sem aparelho digestivo, e caracterizamos parcialmente tal atividade.

ASSUNTO(S)

ca2+ -atpase genetica bruchinae pachymerus nucleorum

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