Seleção de microrganismos produtores de frutosiltransferase e estudo das propriedades bioquimicas da frutosiltransferase de Penicillium sp / Screening of microrganisms for transfructosylating activity and study of biochemical properties of fructosyltransferase from Penicillium sp

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

20/02/2009

RESUMO

t: Impulsionados pela grande demanda por alimentos ¿saudáveis¿ e de calorias controladas, têm surgido desde os anos 80 um grande número de adoçantes alternativos e, entre eles, diversos oligossacarídeos. Entre os oligossacarídeos mais estudados estão os frutooligossacarídeos (FOS), que se tornaram mais importantes por suas propriedades funcionais que pelo seu poder adoçante. Os FOS podem ser produzidos por meio da reação de transfrutosilação catalisada pela enzima frutosiltransferase (FTase), onde uma molécula de sacarose é hidrolisada e o radical frutosil é transferido para outra sacarose. Diversos microrganismos possuem o gene que codifica para a FTase, e sua aplicação industrial já está bem estabelecida, contudo, o Brasil detém apenas uma pequena fração do total de patentes desses processos tecnológicos. Esse trabalho teve por objetivo selecionar novas linhagens microbianas produtoras de frutosiltransferase que sejam eficientes e competitivas com as já descritas na literatura. Para isso, novas linhagens de microrganismos foram isoladas do Baru, um fruto do cerrado. Inicialmente 54 linhagens foram avaliadas quanto à atividade de transfrutosilação, sendo identificadas 13 como potenciais produtoras de FTase. Cada uma das 13 linhagens foi testada com relação à síntese de FOS em diferentes tempos de reação (6, 12, 24, 48 e 72 h), tendo sido utilizadas preparações enzimáticas parcialmente purificadas. A FTase de Penicillium sp. apresentou o maior rendimento da reação de síntese de FOS (50%), sendo as condições de reação 500g.L-1 de sacarose, 20% de enzima (v/v), agitação de 100 rpm, temperatura de 50°C e tempo de reação de 48 horas, em tampão acetato 50 mM (pH 4,5). Baseando-se no rendimento da reação de síntese de FOS, essa linhagem de Penicillium sp. foi selecionada para realização de estudos dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos da FTase. Foi utilizada a metodologia de superfície de resposta para avaliar as condições ótimas de atividade enzimática, sendo estas: pH de 4,8 a 5,2, 54 a 57°C e sacarose (410 a 520 g.L-1). Os parâmetros termodinâmicos tempo de meia vida (t1/2), constante de desnaturação (kd) e valor de redução decimal (D) foram determinados para cada uma das quatro temperaturas estudadas (45, 50, 55 e 60°C). A energia de ativação da desnaturação (Ead) e o valor z também foram calculados para a FTase. A enzima estudada apresentou inibição pelo substrato quando a concentração de sacarose foi superior a 400 g/L. Os parâmetros cinéticos vmax, km e ki foram estimados pelos métodos de linearização de Lineweaver-Burk e Eadie-Hofsteen e pelo modelo de clássico de inibição combinado com o modelo de Hill utilizando o software Statistica® 8.0. A análise das constantes sugere que há um fenômeno de inibição que afeta a enzima e não foi possível a identificação de quais componentes do sistema reacional causam a inibição enzimática, utilizando apenas o modelo clássico de inibição, sendo necessários estudos futuros para desenvolver o modelo cinético adequado para a FTase. Os resultados obtidos indicam que a FTase de Penicillium sp. tem potencial para ser aplicada em processos industriais para produção de FOS Abstract: Nowadays, there is a high demand on health and low caloric food. Since the years of 1980 a big number of sweteners have appeared to replace sucrose. The fructooligosacchrides (FOS) are considered the most important sweeteners among them due their properties to promoting health by increasing of the amount of beneficial bacteria in human gut. They can be produced by simple transfructosilation reaction catalysed by fructosyltransferase (FTase), wherein one molecule of sucrose is hydrolyzed and the fructosyl radical is bonded to another sucrose. Some microorganisms have the gene encoding FTase and its industrial applications are well known. However, Brazil has a small share of patents registered around the world in these technological process. In this work, we aimed to find potential microorganisms strains that produce both FTase and FOS. New strains were isolated from Baru fruits of Brazilian Cerrado biome. Initially 54 isolated strains were screened for transfructosilating activity. As result it was found 13 strains which were able to produce FTase. Enzimatc extracts partially purified from each of 13 strains were evaluated in the ability to produce FOS in several reaction times (6, 12, 24, 48 and 72 h). The reaction conditions were 500 g.L-1 sucrose, 20% (v/v) enzime:solution, 100 rpm, 50°C and 48 h reaction time in acetate buffer 50 mM (pH 4,5). The Penicillium sp. FTase showed the highest yield of FOS synthesis. Hence this strain was selected to study the FTase kinetical and thermodynamical properties. The best conditions found using the Response Surface Methodology were: pH 4.8 to 5.2; 54 to 57°C and 410 to 520 g.L-1 sucrose. The thermodynamic parameters half-life (t1/2), denaturation constant (kd) and the decimal reduction time (D) were calculated to each of the four tested temperatures (45, 50, 55 e 60°C). The activation energy of denaturation (Ead) and the z-value were also calculated. This enzyme showed inhibition by substrate when the sucrose concentration was above 400 g.L-1. The kinetical parameters vmax, km e ki were estimated by Lineweaver-Burk e Eadie-Hofsteen linearization methods. In addition, these constants were also estimated by classic model of inhibition combined with the Hill model using the StatisticaTM 8.0 software. The data analisys indicated an enzimatic inhibition fenomena. However, it was not possible to identify which agents triggered the enzimatic inhibition using only the classic model. It is necessary more future studies to elucidate the appropriated model to FTase. These results sugest that the FTase from Penicillium sp. has a great potential to be applied in further FOS industrial processes

ASSUNTO(S)

seleção microrganismos frutooligossacarideos frutosiltransferase bioquimica penicillium sp screening fructooligosaccharides fructosyltransferase biochemical characterization penicillium sp

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