Purificação de isoformas de fosfolipase A2 a partir do veneno total de Crotalus durissus terrificus e estudo de seus efeitos em mitocondrias isoladas

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

1996

RESUMO

A crotoxina, isolada e cristalizada em 1938 por Slotta e Fraenkel-Conrat a partir do veneno total de Crotalus durissus terrificus mostrou ser um complexo resultante da interação quaternária de duas sub-unidades representadas por uma proteína ácida com massa molecular de 9 kDa denominada crotapotina e um componente básico, com massa molecular de 14,5 kDa que foi identificado como sendo uma fosfolipase A2 (PLA2 ). Esta última é considerada o principal componente responsável pelo desencadeamento dos efeitos farmacológicos induzidos pelo complexo crotoxina. Estudos mais recentes demonstraram a ocorrência de várias isoformas de PLA2, presentes em diferentes lotes de veneno coletados de várias serpentes, sendo tais isoformas decorrentes da expressão de diferentes RNAs mensageiros. As PLA2 (EC 3.1.1.4.) são enzimas que catalisam especificamente a reação de hidrólise da ligação acil-ester na posição sn-2 de fosfoglicerídeos numa reação dependente de álcio, liberando quantidades equimolares de ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. Já foi demonstrado que trações puras de PLA2 apresentam efeitos inibitórios marcantes sobre várias funções mitocondriais, reduzindo as atividades da NADH oxidase, das succinato e NADH-desidrogenase e da capacidade de fosforilação. Além disso, as PLA2 podem modificar a microviscosidade da fase lipídica da bicamada hidrofóbica de membranas, afetando a atividade funcional de enzimas ligadas à membrana, e, através desse mecanismo, regular vários processos metabólicos. No presente trabalho purificamos e caracterizamos, a partir da crotoxina, três isoformas de PLA2 (F1, F2 e F3) com elevado grau de pureza. As isoformas apresentaram massa molecular aparente com valor igual a 15 kDa e alta homologia seqüencial dos 20 resíduos N-terminais em comparação a isoformas já descritas na literatura. o efeito de cada isoforma de PLA2 purificada sobre mitocôndrias isoladas de fígado de rato foi determinado através de consumo de oxigênio durante o estado respiratório 4 e de inchamento mitocondrial. FI apresentou um estímulo dose dependente do consumo de oxigênio enquanto F2 e F3 causaram estímulo apenas em baixas concentrações e inibição em quantidades maiores. Esses efeitos foram completamente abolidos quando soro albumina bovina a 0,1% ou EGTA a 0,5mM estavam presentes no meio de incubação. Usando-se o inchamento mitocondrial como um parâmetro comparativo, todas as isoformas apresentaram o mesmo comportamento com intensidades diferentes, levando à permeabilização da membrana mitocondrial. Neste caso, a adição de EGTA preveniu o inchamento enquanto a soro albumina bovina foi ineficiente, indicando que o microambiente lipídico foi realmente afetado. Esses resultados sugerem que ácidos graxos livres liberados pela ação das isoformas são diretamente responsáveis pelos efeitos observados nos experimentos de consumo de oxigênio. A proteção oferecida pela CSA contra o inchamento causado pelas isoformas, principalmente quando estas estavam presentes em baixas concentrações, sugere que a ligação da CSA a um sítio da membrana mitocondrial protege esta última contra o ataque das PLA2. Já a pequena proteção oferecida pelo CAT, bem como o prevalecimento do pequeno efeito protetor do CAT quando utilizamos simultaneamente CSA e CAT, sugerem que a ligação do CAT ao seu sítio no carreador ADP/ATP impede a proteção conferida pela CSA

ASSUNTO(S)

oxigenio - consumo fosfolipases mitocondria ciclosporina

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