PurificaÃÃo e caracterizaÃÃo de inibidores de tripsina de sementes de Pithecellobium dumosun e seus efeitos / Purification and characterization of trypsin inhibitors of seeds of Pithecellobium dumosun and its effects

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

13/07/2007

RESUMO

Cinco inibidores de tripsina da famÃlia Kunitz (JB1, JB2, JB3-1, JB3-2 e JB4) foram purificados de sementes de Pithecellobium dumosum, uma Ãrvore da subfamÃlia Mimosoideae, por precipitaÃÃo com Ãcido tricloroÃcetico (TCA), cromatografia de afinidade sobre tripsina imobilizada em Sepharose e coluna de fase reversa em sistema de CLAE. Os cinco inibidores possuem massa molecular entre 18 e 20 kDa formados por uma cadeia polipeptÃdica como determinado por SDS-PAGE na presenÃa ou ausÃncia de -mercaptoetanol. JB1, JB3-1 e JB3-2 tÃm massas moleculares de 19,70, 19,69 e 19,69 kDa, respectivamente, por MALDI-TOF. JB2 e JB4 tÃm massa molecular de 18,08 e 20,85 kDa, respectivamente. A seqÃÃncia N-terminal de JB1, JB3-1 e JB3-2 mostrou identidade com outros inibidores da famÃlia Kunitz. Os cinco inibidores foram estÃveis Ãs variaÃÃes de temperatura e pH. A inibiÃÃo da tripsina por JB1, JB2 e JB4 foi do tipo competitivo. JB1, JB2, JB3-1 e JB3-2 tiveram Kis de 3,56 x 10-8 M, 1,65 x 10-8 M, 4,20 x10-8 M, 2,88 x 10-8 M, respectivamente para a tripsina bovina. Em comparaÃÃo com os outros inibidores JB4, com Ki de 5,70 x 10-10 M, apresentou maior afinidade para tripsina. Entre os inibidores purificados apenas JB4 inibiu moderadamente a atividade da quimotripsina. A atividade da elastase e bromelaÃna nÃo foi inibida efetivamente por esses inibidores. A inibiÃÃo de JB1, JB2, JB3-1 e JB3-2 sobre a papaÃna variaram entre 32,93 a 48,82% e foi indicativo de sua bifuncionalidade, com exceÃÃo de JB4 que inibiu fracamente essa atividade (9,93% de inibiÃÃo). A inibiÃÃo da papaÃna por JB1 e JB2 foi do tipo nÃo competitiva e os valores de Ki foram de 7,6 x 10-7 e 5,1 x 10-7 M, respectivamente. Ensaios in vitro sobre as proteinases digestÃrias de Lepidoptera, Diptera e Coleoptera foram feitos. Esses inibidores foram efetivos para enzimas digestÃrias semelhantes à tripsina desses insetos em diferentes graus. As enzimas digestivas de Zabrotes subfasciatus e Ceratitis capitata foram inibidas por JB1 em 68,87 e 65,53%, respectivamente, e as enzimas de Callosobruchus maculatus, Alabama argillaceae e Plodia interpunctella foram inibidas entre 29,18 e 44,35%. Enzimas digestÃrias de Z. subfasciatus, C. maculatus e C. capitata foram inibidas por JB2 entre 70,04 e 74,54% e as enzimas de larvas de A argillaceae e P. interpunctella foram suprimidas em 13,58 e 48,67%, respectivamente. A atividade semelhante à tripsina de larvas de Z. subfasciatus foi suprimida em 67,33 e 56,93% por JB3-1 e JB3-2, respectivamente, e a atividade de C. maculatus, A argillaceae, P. interpunctella e C. capitata foram suprimidas por esses inibidores entre 5,17 e 49,00%. JB4 inibiu entre 54,53 a 66,15 % as enzimas digestivas de C. maculatus, Z. subfasciatus e A argillaceae e inibiu as enzimas digestivas de larvas de P. intepunctella e C. capitata em 8,97 e 37,47%, respectivamente. A inibiÃÃo de proteinases semelhantes à tripsina e à papaÃna presentes no intestino de vÃrios insetos sugere que esses inibidores possam afetar o crescimento e sobrevivÃncia desses insetos pragas quando incorporados em sementes artificiais e esta bifuncionalidade à indicativo de que estes inibidores possam ser fortes candidatos para os programas de melhoramento de plantas via transgenia.

ASSUNTO(S)

bioquimica inibidor de tripsina pithecellobium dumosum insetos praga trypsin inhibitor pithecellobium dumosum insect pests

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