Prospection of antimicrobial peptides from soybean (Glycine max) using proteomics tools / Prospecção de peptídeos antimicrobianos de soja (Glycine max) utilizando ferramentas proteômicas
AUTOR(ES)
Meire de Oliveira Barbosa
DATA DE PUBLICAÇÃO
2008
RESUMO
Técnicas baseadas em separações por cromatografia líquida bidimensional (TDLC) ou multidimensional (MDLC), acopladas à espectrometria de massa (MS), têm sido utilizadas nas separações de proteínas e de peptídeos para estudos de bioprospecção de atividade antimicrobiana. O objetivo deste trabalho foi a prospecção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) de soja (Glycine max) utilizando ferramentas proteômicas. Extratos de sementes de soja não germinadas (SSNG) e de sementes de soja germinadas por 48 horas (SSG48) foram submetidos ao fracionamento salino, aquecimento seletivo, diálise, cromatografia de troca aniônica (CTI) e de fase reversa (C18 RP-HPLC), seguindo-se análises de MS. Comparações dos perfis cromatográficos (CTI e RP- HPLC) de SSNG e SSG48 sugeriram que diferentes peptídeos estão sendo sintetizados, já que massas moleculares (MM) menores que 10 kDa foram identificadas por MS. Ensaio de biorrevelação com a fração catiônica das SSG48 mostrou que compostos com MM abaixo de 14 kDa foram capazes de inibir o crescimento da bactéria fitopatogênica Ralstonia solanacearum. Assim, objetivando conhecer melhor as características do conjunto de AMPs de SSG48, foram avaliadas diferentes metodologias utilizando diferentes técnicas de clareamento e de purificação, e um novo protocolo para a prospecção de peptídeos foi proposto, contendo as seguintes etapas: extração, fracionamento com sulfato de amônio (35-75% sat.), ultrafiltração (membranas com volume de exclusão de 30 e 1 kDa), TDLC (cromatografia de exclusão molecular - CEM e C18 RP-HPLC). As frações obtidas após a C18 RP-HPLC foram aquecidas à ebulição para a remoção dos solventes e utilizadas para ensaios de atividade antimicrobiana, SDSTricina- PAGE e MS. Diferentes frações eluídas da C18 RP-HPLC, após o aquecimento, foram ativas contra cinco bactérias fitopatogênicas, tendo sido identificadas MM inferiores a 10 kDa nessas frações. A avaliação da síntese ou da expressão diferencial de AMPs em SSNG e SSG48 evidenciou que SSG48 apresenta um potencial para a identificação de peptídeos de grande importância funcional, possivelmente envolvidos nos processos de defesa. O ajuste de protocolo permitiu um enriquecimento das amostras em AMPs em SSG48, resistentes à alta temperatura e ao contato com acetonitrila e TFA, ainda não descritos, podendo essas características ser exploradas para aplicação biotecnológica na agroindústria. Paralelamente, utilizando ferramentas de bioinformática, foram realizadas buscas em banco de dados (NCBI) visando à identificação de seqüências de DNA que codificam para AMPs em soja. Uma seqüência de uma provável defensina foi obtida e clonada em Escherichia coli. O plasmídeo de expressão (pPIC 9) contendo a defensina foi linearizado e utilizado para a transformação de Pichia pastoris, um transformante His+ foi utilizado para avaliar a expressão da defensina recombinante, e SDS-Tricina-PAGE para verificar a expressão. A avaliação por SDS-Tricina-PAGE não permitiu confirmar a expressão da defensina até o momento, sob as condições utilizadas. A identificação e clonagem de uma possível defensina foram realizadas com sucesso, e sua expressão vem sendo buscada, o que provavelmente possibilitará sua caracterização para aplicações biotecnológicas diversas.
ASSUNTO(S)
defesa de plantas antimicrobial peptides proteomics proteinas defense processes in plants soybean peptídeos antimicrobianos proteômica soja
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