Padronização de tecnicas moleculares para o estudo da resistencia a drogas antiretrovirais em crianças infectadas pelo virus da imunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) via perinatal / Antiretroviral drug resistance in infected Brazilian children by human immunodeficiency virus type 1

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

Investigamos a presença de mutações em crianças infectadas verticalmente pelo vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) que conferem resistência aos agentes antiretrovirais. Amostras de sangue periférico foram coletadas de sessenta e seis pacientes em seguimento no do Ambulatório de Pediatria do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas. A partir de leucócitos destas amostras foi extraído o DNA, após diversas lavagens e precipitações. Foi preparado um Mix para 20 reações contendo 100µl de Buffer (50 mM de cloreto de potássio; 20 mM de Tris-HCl - pH 8,4); 100 µl de cloreto de magnésio (25mM); 12µl da mistura desoxirribonucléica - dNTPs (dATP, dGTP, dCTP; dTTP) a 25mM, 10µl de cada ?primer? (25pmoles/µl); 0,5µl de Taq DNA polimerase e 0,5 µl do DNA a ser estudado, para a realização da PCR. As condições da reação foram: Desnaturação: 95ºC - 3 minutos; Anelamento: 55ºC ? 1 minuto; Extensão: 72ºC - 1 minuto (3 ciclos). Desnaturação: 95ºC ? 1 minuto; Anelamento: 55ºC ? 45 segundos; Extensão: 72ºC ? 1 minuto e Extensão final: 72ºC por 10 minutos (35 ciclos). As bandas foram visulizadas em gel de agarose 1%, obtendo-se uma banda de 1008 pares de bases. Os produtos selecionados foram submetidos a seguinte reação de seqüenciamento: 1,0 µl do produto da PCR; 4,0 µl de Premix (Amersham); 1,0 µl de primer 5 µM; Completar com dH2O para 10,0 µl de reação. Após a amplificação, os fragmentos foram analisados pelo Software MegaBACE? Sequence Analyzer, em seguida alinhados e comparados com o banco de dados público (GenBank), com o vírus selvagem, e com o programa Phred, Phrap, Consed. As principais mutações encontradas no gene da Transcriptase reversa foram: M184V(42,6%), M41L (39,3%), D67N (27,9%), T215Y (26,2%) e K70R (18%). No gene da Protease as principais encontradas foram: L63P (42,6%), L90M e M36I (32,8%), V77I (29,5%), I93L (24,6%), V82A (16,4%), I54V (14,8%) e K20R (13,1%). Concluímos que este método é muito eficaz para análise das seqüências, auxiliando na observação das mutações. Este exame deveria ser implantado na rotina para os pacientes portadores deste vírus, pois auxiliaria os clínicos na escolha de uma terapia ideal para cada paciente. As crianças que apresentavam estas mutações associadas às drogas antiretrovirais estavam com o quadro clínico afetado e a maioria dos esquemas terapêuticos não reduziam a carga viral em níveis desejáveis

ASSUNTO(S)

highly active resistance terapia anti-retroviral de alta ativide hiv-1 haart pcr antiretroviral therapy viral resistencia viral a drogas reação em cadeia de polimerase drug resistance

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