Inibidores de peptidases das sementes de pau-brasil em modelo de inflamação pulmonar / Peptidase inhibitors from pau-brasil seeds on a pulmonary inflammation model

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2010

RESUMO

Elastase de neutrófilos (EN) e catepsina G (Cat G), importantes peptidases na defesa contra mircoorganismos, têm suas atividades rigorosamente controladas por inibidores endógenos; entretanto, quando ocorre algum desequilíbrio entre essas enzimas e seus inibidores podem ocasionar algumas doenças, como o edema pulmonar. Sabe-se que o tratamento do edema pulmonar com inibidores de EN pode resultar em uma diminuição da severidade da doença; mas, pouco se conhece sobre os inibidores de Cat G nesse processo, além disso, os inibidores disponíveis no mercado, possuem efeitos colaterais graves ou baixa eficiência, tornando justificada a busca por novos inibidores. Nosso laboratório vem, há algum tempo, purificando e caracterizando, clonando e expressando inibidores de peptidases contidos em sementes de Caesalpinia echinata (pau-brasil), como um inibidor de calicreína plasmática que também inibi Cat G (CeKI) e outro de EN e Cat G (CeEI). Sendo assim, seria interessante explorar a ação desses inibidores na fisiopatologia do edema pulmonar, para uma melhor compreensão da participação de cada uma dessas enzimas na patologia. Para isso, os objetivos desse trabalho foram expressar, purificar e caracterizar o CeEI recombinante, determinar o menor peptídeo ativo do inibidor e testá-los em um modelo animal in vivo de edema pulmonar, além de verificar o papel da EN em uma cultura de células epiteliais alveolares do tipo II. Após a clonagem do fragmento de cDNA (700 pb), obtiveram-se duas seqüências, com o mesmo sítio reativo (rCeEI-4 e rCeEI-5) que foram avaliados quanto à sua especificidade na hidrólise de substratos sintéticos. Embora a ação de ambos inibidores sobre EN seja enzimaticamente classificada como parcial mista, eles apresentaram afinidades diferentes com relação à Cat G. Para a obtenção do menor peptídeo ativo, com base na sequencia primária e terciária do inibidor foram delimitados três possíveis fragmentos ativos, dois dos quais foram produzidos por Biologia Molecular e um sintetizado. Chegou-se à conclusão de que era necessária a seqüência completa do inibidor para sua melhor atividade e estabilidade. Para o modelo in vivo de edema pulmonar, soluções do CeKI, ou do rCeEI-4, em diferentes concentrações, foram injetadas na cauda de ratos Wistar. Em seguida, os animais receberam lipopolissacarídeo pela traquéia e, após seis horas, foram mortos, procedendo-se a sangria, lavagem broncoalveolar (BAL) e processamento do pulmão para análise. Nesse modelo in vivo, observou-se que os animais tratados com os dois inibidores apresentaram número de células polimorfonucleares diminuído no BAL. Tanto no BAL quanto no sangue, o tratamento com inibidores diminuiu a concentração de cininas e no pulmão, observou-se uma diminuição da atividade de Cat G, entretanto só houve diminuição das atividades do tipo EN e de mieloperoxidase, quando os animais foram tratados com rCeEI. Em relação às citocinas, foi observado que somente o rCeEI foi capaz de aumentar as concentrações de interleucina 6. Isso indica que apesar de ambos inibidores serem capazes de diminuir o processo inflamatório agudo do pulmão, rCeEI agiu de uma forma mais efetiva. Para a cultura de células pulmonares do tipo II, foram utilizados ratos Wistar recém-nascidos e a identificação das células foi feita com anticorpo anti-proteína C associada a surfactante pulmonar. EN parece induzir a morte celular, do tipo apoptose, nessas células, aumentando a gravidade da doença.

ASSUNTO(S)

caesalpinia echinata (pau-brasil) inibidores de proteases edema pulmonar elastase catepsina g biologia molecular

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