Estratégias de cultivo para a produção de polissacarídeo capsular por Haemophilus influenzae tipo b e determinação de parâmetros de qualidade para o produto / Cultivation strategies for capsular polysaccharide production by Haemophilus influenzae type b and determination of quality parameters for the product

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2010

RESUMO

Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma bactéria Gram negativa responsável por causar meningite em todo o mundo. O polissacarídeo capsular b, um polímero composto por unidades repetidas de ribosil-ribitol-fosfato (PRP) e o principal fator de virulência, sendo utilizado na formulação da vacina contra este microrganismo. Apesar de sua elevada eficiência, a vacina conjugada contra Hib é um produto de alto custo de produção por envolver processos de fermentação, purificação e conjugação para obtenção de um produto final dentro das especificações da Organização Mundial da Saúde (OMS). O melhoramento do meio de cultura e das condições de cultivo pode contribuir para redução do custo desta vacina de forma a facilitar sua difusão nos países subdesenvolvidos. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi identificar condições de cultivo que resultem em maior produção de polissacarídeo capsular, contribuindo para reduzir os custos nas etapas de purificação e conjugação. Os ensaios foram conduzidos em frascos agitados ou em biorreatores com 7 a 13 litros de capacidade nominal. A temperatura foi mantida em 37oC, o pH controlado em 7,5 através da adição de NaOH 5M e a concentração de oxigênio dissolvido (COD) mantida em 30 % da saturação do ar. A vazão especifica de ar variou entre 0,2 e 1 VVM. Amostras foram coletadas em intervalos regulares de tempo para mensurar densidade óptica (DO540nm), concentração celular, produção de polissacarídeo capsular (PRP) e concentrações de glicose e metabolitos. Duas possibilidades para aumentar a produção de polissacarídeo foram estudadas: 1) diferentes estratégias de cultivo descontinuo alimentado consistindo por: a) adição intermitente de glicose (CDAIG), b) vazão constante (CDAVC), c) vazão exponencial (CDAVE), e d) reciclo de células seguido de perfusão (CDAVE+P)); e 2) o melhoramento da composição do meio de cultura quanto à relação carbono/nitrogênio através do uso da metodologia de delineamento composto central rotacional (DCCR), tendo como variáveis independentes: Peptona de Soja (S), Extrato de Levedura (EL) e Glicose (G). Parâmetros de qualidade também foram avaliados para verificar o perfil da massa molecular do produto (PRP) e os aspectos morfológicos do microrganismo. Os resultados das diferentes estratégias de cultivo juntamente com os resultados da analise econômica do custo dos processos estudados mostraram que o CDAVC, com custo de US$ 425.50/g PRP por ano e produtividade de 88 mg/(L.h), demonstrou ser a melhor alternativa para o processo de produção de PRP por apresentar menor custo com boa produtividade. Já o estudo da composição do meio de cultura através da analise estatística dos resultados do DCCR mostraram que a melhor composição do meio de cultivo (MMC) consistia em S de 5 g/L, EL de 5,5 g/L e G de 15,25 g/L. Valores de DO540nm de 8,4 e de produção volumétrica de polissacarídeo de 410 mg PRP/L foram alcançados em experimentos de validação na condição MMC realizados em shaker. Para o ensaio de validação da condição MMC em reator, a concentração de biomassa de 3,0 g MS/L e a produção de polissacarídeo capsular de 600 mg PRP/L foram observadas. Valores semelhantes foram obtidos em experimentos de validação realizados em shaker e biorreator na condição CPC, mostrando que tanto a condição CPC como a MMC pertencem a região de ótimo. A analise dos parâmetros de qualidade mostrou que o tempo de cultivo influencia fortemente no tamanho da molécula do polissacarídeo, sendo que quanto maior o tempo de cultivo, menor a sua massa molecular. A analise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) das células de H. influenzae mostrou a predominância de células com morfologia arredondada na sexta hora de cultivo, enquanto que, na décima segunda hora de cultivo, as células apresentaram morfologia mais alongada e exibiram a presença de inclusões citoplasmáticas na forma de grânulos, possivelmente devido ao acumulo de algum material de reserva. Diante dos resultados obtidos, a nova composição de meio resultou em maior crescimento celular e produção de polissacarídeo capsular, com metade das concentrações das fontes de nitrogênio (peptona de soja e extrato de levedura), o que reduz o custo de produção. Os cultivos que resultaram em maior produção e produtividade foram o CDAVC (1600 mg PRP/L e 88 mg PRP/L.h) e o CDAVE+P (1800 mg PRP/L e 129 mg PRP/L.h), sendo que este ultimo (CDAVE+P) atingiu produtividade 30 % maior que o melhor resultado ate então descrito na literatura (90 mg PRP/L.h). No entanto, o cultivo CDAVC apresentou maior viabilidade do ponto de vista econômico e de execução e passível de escalonamento.

ASSUNTO(S)

fermentação economical analysis fed-bach cultivation central composite rotational design parâmetros de qualidade polissacarídeo capsular capsular polysaccharide quality parameters cultivo descontínuo alimentado haemophilus influenzae tipo b polissacarídeo capsular haemophlius influenzae type b engenharia bioquímica delineamento composto central rotacional análise econômica outros

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