Engenharia genética de um sistema de expressão duradoura e seletiva do VEGF para condição isquêmica baseado no sistema integrase C31 e HRE / Genetic engineering of selective and long term VEGF expression to ischemic condition based on integrase C31 system and HRE

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2010

RESUMO

A doença arterial periférica é caracterizada pelo fluxo insuficiente de sangue para as extremidades e afeta mais de 10 milhões de pessoas no mundo podendo ocorrer fortes dores, úlceras não-cicatrizantes e perda do membro afetado. Com o intuito de auxiliar esses pacientes, a terapia gênica vem apresentando novos estudos para estimular o processo de neoangiogênese através da injeção de genes que codificam fatores de crescimento. Dentre os problemas da utilização da terapia gênica para doenças isquêmicas, o descontrole de expressão dos transgenes é o principal. A maioria dos vetores utilizados, devido ao descontrole dos níveis de expressão, podem acarretar em processos de angiogênese patológica. O vetor ideal para esta condição seria aquele que possuísse um mecanismo de reconhecimento da condição isquêmica para regular a expressão do transgene e ao mesmo tempo fosse integrado no genoma da célula hospedeira perpetuando sua ação. Desta forma, a duração da expressão gênica seria longa o suficiente para a recuperação do tecido isquêmico e o seu nível seria regulado conforme a variação da concentração de oxigênio local. Portanto, esta tese tem como objetivo principal elaborar um vetor que satisfizesse tais condições utilizando o gene do fator de crescimento endotelial vascular humano (hVEGF). Para transferi-lo foi construído o vetor utilizando o sistema integrase C31, que tem se mostrado capaz de mediar a integração e expressão do transgene no genoma das células de maneira robusta e estável. Junto a esse sistema, foram inseridas também as 9 cópias da seqüência consenso do elemento de resposta à hipóxia (HRE) com o intuito de controlar a expressão de acordo com a concentração de oxigênio. ELISA, PCR, avaliação do grau de necrose, determinação da força e peso muscular e imunohistoquímica foram realizados para avaliar o comportamento do vetor e sua eficácia no tratamento da isquemia. Os resultados demonstraram a capacidade integrativa e de expressão duradoura do vetor tanto in vitro quanto in vivo. A presença das 9 cópias da seqüência HRE, sob condição de hipóxia, possibilitou a modulação da expressão gênica com o aumento da concentração da proteína. Tais características resultaram em grande melhora do aspecto visual do membro isquêmico ficando evidente a ação do hVEGF em termos de aumento da força e massa muscular, diminuição de tecido fibroso e aumento do número de vasos. Este estudo sugere que a ação conjunta dos sistemas integrase C31 e HRE pode prolongar e modular a expressão gênica além de possibilitar uma melhora no tratamento para o modelo murino de isquemia de membro.

ASSUNTO(S)

terapia gênica isquemia de membros vegf integrase c31 hre biologia molecular system and hre genetic engineering

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