Development of Immunochemical and Molecular Assays for the Diagnosis of Leptospirosis / Desenvolvimento de Testes Imunoquímicos e Moleculares para o Diagnóstico da Leptospirose

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

A Leptospirose é uma zoonose de ocorrência mundial causada por bactérias do gênero Leptospira. As manifestações clínicas da leptospirose são similares a outras doenças febris e este fato frequentemente atrasa o diagnóstico e o início do tratamento. Portanto, o diagnóstico precoce e acurado da doença é um prerequisito para o tratamento adequado. Sorovares patogêncios de Leptospira possuem uma grande variação antigência e esta diversidade é atribuída principalmente ao lipopolissacarídeo presente na membrana externa. Contrastando com esta característica, antígenos conservados de sorovares patogênicos são principalmente representados por proteínas de membrana externa. Recentemente foi comprovada a exposição da proteína LipL32 na superfície da membrana externa de leptospiras patogênicas. Neste estudo, LipL32 em sua forma recombinante (rLipL32) foi utilizada para imunizar camundongos BALB/c e produzir anticorpos monoclonais (mAbs). Três mAbs contra rLipL32 foram produzidos e caracterizados quanto ao seu potencial para uso em testes diagnósticos usando diferentes metodologias. Os mAbs foram conjugados à peroxidase e avaliados quanto a reação com proteina nativa em células de leptospiras íntegras e rompidas, conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) para uso em imunofluorescência para marcar células de leptospira intactas e tratadas com metanol, e usados para imunoprecipitar células de leptospira. Os anticorpos monoclonais anti-LipL32, utilizados em ELISA tanto conjugados com peroxidase ou como anticorpo primário, ligaram-se às células de leptospiras intactas ou rompidas pelo calor, provando que podem ser usados em testes imunoenzimáticos para detecção da proteína nativa. Na imunofluorescência, os mAbs foram capazes de marcar células da bactéria tanto intactas como fixadas com metanol. Dois mAbs foram capazes de imunoprecipitar proteina nativa de leptospiras vivas e móveis, e quando adsorvidos em partículas magnéticas foram capazes de capturar bactérias para amplificação por PCR. Na seqüência deste estudo, o mAb 1D9 foi utilizado em estudos de padronização da metodologia de imunoseparação magnética associada a PCR (IMS/PCR) para diagnóstico de leptospirose. O anticorpo 1D9 foi adsorvido em partículas magnéticas e utilizado para capturar leptospiras em soro e urina humanas artificialmente contaminadas com leptospiras para posterior amplificação. Para assegurar a acurácia da PCR foi construído um controle interno de amplificação (IAC) específico para a metodologia desenvolvida utilizando como alvo sequências de primers já padronizados para exclusiva amplificação de leptospiras patogências e uma sequencia de DNA não relacionada. A metodologia de IMS/PCR IAC permitiu usar somente um par de primers na reação de PCR e mostrou ser promissora para diagnóstico de leptospirose, pois foi capaz de detectar 102 células por mL em amostras de soro e urina artificialmente contaminadas, correspondendo a amplificação a partir de aproximadamente 25 cópias do genoma. Os resultados obtidos evidenciam uma nova perspectiva no diagnóstico da leptospirose através da utilização da proteína LipL32 em métodos imunoquímicos e moleculares ou pela associação destas metodologias. A metodologia de imunoseparação com o mAb anti-LipL32 pode ser utilizada previamente a amplificação de outros alvos do genoma bacteriano por PCR, já que ela possibilita a separação e concentração exclusiva de Leptospira patogênica.

ASSUNTO(S)

lipl32 monoclonal antibodies bacterologia diagnóstico laboratorial leptospirose pcr pcr laboratory diagnosis anticorpos monoclonais lipl32 leptospirosis

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