Construção de biblioteca metagenômica de DNA microbiano do solo amazônico e prospecção de enzimas de interesse biotecnológico

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

30/06/2011

RESUMO

Problemas relacionados a diminuicao dos estoques de combustiveis fosseis, politicos e ambientais tem levado a busca de alternativas renovaveis. A biomassa vegetal e abundante e barata, sendo candidata ideal para producao de biocombustiveis; entanto, o material lignocelulosico presente na parede celular das plantas possui estrutura complexa e atualmente nao existem metodos eficazes que sejam economicamente viaveis para que este seja utilizado como materia-prima na producao de bioetanol. Enzimas microbianas tem amplo historico de aplicacao industrial e sao capazes de romper as ligacoes complexas da parede celular de plantas. Devido a quantidade de materia organica na Floresta Amazonica, existe um grande numero de microrganismos participando sua biodegradacao. A microbiota associada ao bioma Amazonia e relativamente pouco explorada biotecnologicamente. Alem disso, ja que apenas 1% dos microrganismos pode ser cultivado no laboratorio, tecnicas moleculares que dispensam o cultivo sao as mais adequadas para aplicacoes biotecnologicas. Para ultrapassar essa barreira, pode-se utilizar a tecnica do metagenoma, onde a fracao bacteriana da microbiota completa de uma amostra e explorada por tecnicas moleculares. Neste trabalho, foi construida uma biblioteca metagenomica de expressao de pequenos insertos (de 3 a 8 kb) a partir do DNA microbiano encontrado no solo Amazonico, contendo 70.000 clones clonados em E. coli EPI300. Ela foi dividida em duas partes: biblioteca 1, com 30.000 clones, e biblioteca 2, com 40.000 clones. Esta biblioteca foi triada para atividades enzimaticas de amilase, À-glicosidase, CMCase, lipase, protease, quitinase e xilanase, tendo sido encontrados um clone de amilase, doze À-glicosidases, onze CMCases, tres quitinases e onze xilanases. Somente tres clones foram escolhidos para serem estudados em detalhe e sequenciados: AmAmi01 (amilase), AmEndo02 (CMCase) e AmEndo03 (CMCase). Apos o sequenciamento e analise destes, descobriu-se que o clone AmAmi01 tem uma ORF para amidase e nao amilase. Este fato apresenta possivelmente uma nova estrategia de triagem para a atividade de amidase. O clone AmEndo02 nao tem nenhuma ORF conhecida para atividade celulolitica e o AmEndo03 tem uma ORF para uma À-manosidase. E fato que algumas enzimas apresentam promiscuidade com substratos. Com isso, os clones AmEndo02 e AmEndo03 foram inoculados em meio LB agar contendo diferentes tipos de CMC (0,1%, m/v), xilana de birchwood (0,5%, m/v) e quitina coloidal (2%, m/v), onde apresentaram atividade em todos os substratos. Foram desenvolvidos primers para amplificar a ORF do AmEndo03 codificando para a À-manosidase. Futuramente, estes primers serao utilizados para sub-clonar e expressar esta ORF para se obter a proteina de interesse purificada. Esta sera utilizada em ensaios mais especificos e sensiveis, sem a necessidade de um hospedeiro. Devido a similaridade desta ORF equivalente do clone AmEndo03 com proteinas resolvidas experimentalmente e depositadas no banco de dados PDB, foi gerado um modelo com um ligante que e possivelmente inibidor da proteina. Para testar in vitro se o inibidor realmente se liga ao sitio catalitico gerado (e, portanto, confirmar a veracidade do modelo gerado), o inibidor foi testado na concentracao de 0,1M em meio LB agar com CMC a 0,1% (m/v). Porem, este inibidor provou-se toxico para a E. coli EPI300, enfatizando a necessidade de obtencao da proteina de interesse do clone AmEndo03 purificada para a pratica de ensaios enzimaticos. Foram feitos estudos filogeneticos com as sequencias proteicas da ORFs de interesse dos clones AmAmi01 (amidase) e AmEndo03 (À-manosidase), provando que o DNA do inserto de ambos provem de bacterias. Este trabalho e somente um esforco inicial para a exploracao biotecnologica sustentavel da riqueza metabolica da microbiota do solo Amazonico. Conclui-se que a metagenomica e uma tecnica que permite a exploracao biotecnologica de microorganismos ainda desconhecidos, mas tambem ha uma grande necessidade de melhoramento nas tecnicas de bioensaios para atividades enzimaticas.

ASSUNTO(S)

energia da biomassa amazônia microorganismos do solo enzimas microbianas genetica metagenome biofuels amazon soil microbial enzymes glycosyl hydrolases

ACESSO AO ARTIGO

Documentos Relacionados