Molecular Characterization of Plasmid pLK39 Extracted From A Endophytic Bacteria Isolated From Wolf Apple / Caracterização Molecular Do Plasmídeo pLK39 Extraído De Uma Bactéria Endofítica Isolada De Solanum Lycocarpum

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2002

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi caracterizar o plasmídeo pLK39. Este plasmídeo foi extraído de uma bactéria endofítica Gram-negativa, isolada da folha de Solanum Lycocarpum (Lobeira). Este plasmídeo apresenta um tamanho de aproximadamente 4,5 kb. Visando obter uma marca de seleção para permitir sua caracterização em células de Escherichia coli, foi introduzido o gene de resistência à Kanamicina, extraído do plasmídeo pUC4K. A caracterização do pLK39 foi realizada através de estudos de estabilidade, incompatibilidade, estimativa do número de cópias e através de seqüenciamento de parte do plasmídeo. A estabilidade foi testada em células de Escherichia coli XL10. Células transformadas com pLK39 foram cultivadas em meio Lúria suplementado com Kanamicina (50 μg/mL) durante 24 horas uma amostra da cultura era plaqueada em meio seletivo e em meio sem pressão seletiva parte dessa amostra foi inoculada em meio Lúria sem pressão seletiva e incubado por 24 até atingir 240 gerações. Após 240 gerações 81.5% das células mantiveram o plasmídeo, mostrando que o pLK39 é bastante estável em células de Escherichia coli. Para realização do teste de incompatibilidade, células de Escherichia coli XL10 foram co-transformadas com os plasmídeos pLK39/pUC18, pLK39/pBR322 e pLK39/pACYC184. Após 240 gerações, foi detectada a presença do plasmídeo pLK39 em todos os sistemas testados, demonstrando a compatibilidade do pLK39 com os plasmídeos testados. O número de cópias do pLK39 foi estimado através da comparação da intensidade das bandas plasmidiais, obtidas através de eletroforese em gel de agarose, realizada a partir de uma extração de plasmídeos de células de Escherichia coli XL10 transformadas com pUC18, pBR322 e pLK39. A quantificação de cada banda foi realizada utilizando o sistema de fotodocumentação e analise (KODAK EDAS). O número de cópias do pLK39 foi estimado em 25 cópias por células. O plasmídeo pLK39 foi digerido com enzima de restrição Sau3AI e sub-clonado no sítio de BamHI do plasmídeo pUC18. Os clones recombinantes foram seqüenciados. Foi obtido um fragmento com 1.637 pb. Essa seqüência apresentou uma grande homologia com os plasmídeos pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000 e pBERT, os quais foram isolados de diferentes bactérias Gram-negativas. A seqüência apresentou dois possíveis genes. A ORF I apresentou grande homologia com o gene mobB dos plasmídeos pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%), pUCD5000 (94%) e pBERT (87%). A ORF II apresentou homologia com o gene mobD dos plasmídeos pSW200 (92%), pSW100 (90%), pEC3 (90%) e PUCD5000 (89%).

ASSUNTO(S)

plasmídeo bactéria endofítico 1.microorganismos endofíticos 2.plasmídeos 3.plasmídeo plk39 plasmid bactéria dna endophytic bioquimica dna

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