Bioferramenta analítica : produção e desenvolvimento empregando anticorpo monoclonal antiaflatoxina (hibridoma AF2 e AF4)

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

27/02/2009

RESUMO

Aflatoxinas (AFs) constituem grupo de metabólitos secundários fúngicos de importância relevante na segurança de alimentos, com ênfase ao controle de aflatoxina B1 em commodities da cadeia produtiva agropecuária. O monitoramento de micotoxinas em alimentos requer método analítico sensível, específico, exato, preciso e robusto. A análise quantitativa pode ser procedida por métodos químicos (CLAE, CCD, CG) e imunoquímicos (ELISA). A coluna de imunoafinidade (CIA) emprega anticorpo específico e, constitui método de escolha para a limpeza e concentração do analito. O estudo propôs cultivo de hibridoma linhagem AF2 e AF4 para produção de anticorpo monoclonal (AcM) in vitro em meio RPMI + 15 % de soro fetal bovino (SFB), assim como o mesmo meio com adição gradual de H-SFM (25, 50, 75 e 100 % H-SFM). A concentração proteica foi avaliada a 280 nm nas etapas de pós-cultivo, pós-precipitação com (NH4)2SO4 e pós-diálise. A produção de AcM por hibridoma AF2 correspondeu à concentração média proteica de 2,94 mg/mL, enquanto que o hibridoma AF4 produziu 2,7 mg/mL. Embora AcM produzido pelo hibridoma AF4 apresente maior especificidade para AFB1, para ensaios posteriores optou-se pelo hibridoma AF2, devido a facilidade no cultivo. Maior produção de AcM por AF2 ocorreu em cultivo contendo 50, 75 e 100 % H-SFM (eletroforese e i-ELISA em dialisado pós-precipitado com (NH4)2SO4). Entre estes, o AcM produzido em 100 % de H-SFM (isento de SFB) e precipitado com saturação de 50 % de (NH4)2SO4 apresentou menor teor de interferentes, sendo portanto, o procedimento indicado para obter Ac de qualidade destinado ao desenvolvimento de bioferramentas. O AcM produzido foi destinado ao desenvolvimento de ic-ELISA, que apresentou limite de detecção de 4,95 ng/g. Empregando este ic-ELISA, analisou-se AFB1 em páprica (03), paçoca (02), pé de moleque (01) e milho (03), considerando que estas amostras sejam positivas em análise prévia realizada em Instituto Adolfo Lutz-SP (IAL), Kagawa University-JP (KUJ) e milho positivo pertencente ao monitoramento realizado no Norte do Paraná-BR. O resultado preliminar em amostra de milho A5 indicou nível de AFB1 detectado por ic-ELISA desenvolvido (12,8 ng/g) semelhante ao valor obtido no IAL (19,2 ng/g). O mesmo pode ser inferido perante análise de milho B, uma amostra altamente contaminado perante ic-ELISA (310,66 ng/g), em relação ao valor detectado no KUJ empregando CIA-CLAE (333,04 ng/g) e coluna multifuncional-CLAE (296,45 ng/g). Contudo, principalmente nas amostras de páprica ocorreu reação falso-positivo com superestimação dos valores devido à intensa interferência de matriz, inviabilizando o uso do ic-ELISA desenvolvido para este grupo alimentar. Outrossim, para viabilizar a aplicação deste ic-ELISA ainda deve-se aperfeiçoar a etapa de extração e limpeza de extrato, assim como aumentar a sensibilidade. Paralelamente, introduziu-se a confecção de CIA empregando AcM produzido, sendo isso também o primeiro passo para o desafio visando montagem de imunobioferramentas da categoria de biosensores. A eficiência de acoplamento do AcM antiAFB1 ao suporte Affi-Gel 10 variou de -8,03 a 80,61 %, indicando ser altamente promissor para prosseguir introduzindo a montagem de imunobiosensores. Ainda assim, deve-se prosseguir para a validação de CIA desenvolvida, assim como reutilização, capeamento e estabilidade visando suporte com alta especificidade, capaz de assegurar a qualidade de produto desenvolvido. A produção de AcM reduziria a dependência da importação de kits para análise de micotoxina e consequentemente, o custo da análise no controle de qualidade, constituindo em técnica alternativa indispensável na triagem de aflatoxinas em matriz alimentar.

ASSUNTO(S)

alimentos - microbiologia aflatoxina micotoxinas food microbiology

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