Avaliação do efeito da suplementação com proteínas lácteas sobre pacientes com leucemia mieloide aguda (LMA), na mucosite induzida por quimioterápicos e em células leucêmicas / Evaluation of the effect of the supplementation with milk proteins on patients with acute myeloid leukemia (AML) in chemotherapy-induced mucositis and leukemic cells

Fabiane La Flor Ziegler

O objetivo geral da presente pesquisa foi avaliar o efeito de um concentrado de proteínas do soro do leite bovino (WPC) enriquecido com o fator de crescimento e transformação beta (TGF-?) e lactoferrina, em pacientes pediátricos com Leucemia Mieloide Aguda - LMA (Capítulo 2); desenvolver um modelo de mucosite gastrointestinal induzida por quimioterápicos, em ratos Wistar, para posterior avaliação da eficácia das proteínas lácteas na proteção da mucosa (Capítulo 3); avaliar os efeitos pelo WPC e por uma caseína comercial, in vivo e in vitro sobre células leucêmicas humanas transplantadas em camundongos imunodeficientes (NOD/SCID) e em cultura de células (Capítulo 4). Para todos os estudos foi utilizado WPC enriquecido com TGF-??e lactoferrina doado pela empresa Hilmar Cheese Company (Cal, USA). No capítulo 2 realizou-se estudo de intervenção nutricional, prospectivo, duplo cego com placebo controlado, onde foram avaliados 21 pacientes, entre 0 a 19 anos, virgens de terapia, admitidos no Centro Infantil Boldrini, Campinas - SP. Foram avaliados quanto à adequação da ingestão alimentar, estado nutricional (EN), dosagem de glutationa (GSH) eritrocitária, hemograma, produção de citocinas no plasma e em cultura de células, imunoglobulina A salivar e evolução da mucosite. Foram comparados os resultados bioquímicos dos pacientes com um grupo controle de indivíduos saudáveis da mesma faixa etária. Utilizou-se o software SPSS para as análises estatísticas (p<0,05). O protocolo de pesquisa foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) com registro 14097. Tomados em conjunto os resultados indicaram que o WPC apresentou efeito positivo sobre o EN dos pacientes, porém não influenciou na composição corporal. A distribuição % dos macronutrientes estava adequada em todos os tempos para os grupos WPC e maltodextrina (placebo), mas o % de adequação dos micronutrientes não atendia às recomendações em sua maioria. As análises bioquímicas não evidenciaram superioridade do WPC em relação ao placebo. Não houve diferença significativa entre os grupos sobre a avaliação clínica da mucosite oral. Na comparação dos pacientes com LMA e indivíduos saudáveis (controle) pode-se constatar níveis estatisticamente superiores do controle nos parâmetros bioquímicos de albumina, pré-albumina, eritrócitos, hematócrito, hemoglobina, plaquetas, produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10) e interferon gama (IFN-?) quando estimuladas pela vacina BCG liofilizada e produção de IL-6 quando estimulada por fitohemaglutinina (PHA). No entanto, para a concentração de GSH eritrocitária e produção espontânea das citocinas TNF-??e IFN-??verificou-se que os pacientes com LMA apresentaram níveis estatisticamente superiores em relação ao controle saudável. No capítulo 3 foi elaborado um protocolo de indução de mucosite em ratos Wistar testando-se os quimioterápicos 5-Fluoruracila (5-FU) e sulfato de vincristina (SV), em administrações de diferentes concentrações e número de doses. Através desse experimento concluiu-se que o SV não foi um bom agente indutor de mucosite, ao contrário do 5-FU. A partir desses resultados foram realizados experimentos com 5-FU visando ajuste das condições dos experimentos inclusive do número, periodicidade e concentração das doses do quimioterápico. O melhor modelo de indução de mucosite gastrointestinal foi obtido através da administração de 3 doses de 5-FU com intervalo de 3 dias entre cada dose, nas concentrações entre 50 e 70 mg/Kg/dose. Os índices bioquímicos não foram influenciados pelo efeito da peletização da dieta e, de modo geral não houve diferença significativa entre os grupos tratados com WPC e com caseína. Independente da natureza da proteína (WPC ou caseína) observou-se maior proteção contra o 5-FU quando os animais receberam as dietas previamente à administração do quimioterápico. Ao contrário do esperado, o estímulo imunológico com hemáceas de carneiro não promoveu aumento nos níveis de GSH nos eritrócitos. As proteínas do soro do leite protegeram a mucosa, em termos de promover menor intensidade de mucosite, nos períodos mais críticos (72h após a 2ª e a 3ª dose de 5-FU) nas regiões de maior prevalência, duodeno e jejuno, quando se comparou com os resultados obtidos para os grupos tratados com caseína. Para os experimentos in vivo, do capítulo 4, utilizaram-se células de leucemia linfóide aguda (LLA) pediátrica humana, isoladas de pacientes do Centro Infantil Boldrini, as quais foram inoculadas em camundongos NOD/SCID. Nesses experimentos, utilizou-se dieta AIN-93G com WPC ou caseína e dieta comercial e o quimioterápico SV. Avaliou- se: peso corporal, consumo de dieta, razão entre peso dos órgãos (rim, baço e fígado) e peso corporal, evolução da leucemia, tempo de sobrevida, hemograma e níveis de glutationa em eritrócitos do sangue periférico. Nos experimentos in vitro foram usadas 6 linhagens celulares: K562 (Leucemia Mieloide Crônica), Nalm-6 (Leucemia Linfóide Aguda do tipo B), Jurkat (Leucemia Linfóide Aguda do tipo T), CEM (Leucemia Linfóide Aguda do tipo T), RAMOS (Linfoma Burkitt) e HL-60 (Leucemia Mieloide Aguda). Foram testadas a citotoxicidade (IC50) do WPC, a viabilidade celular e os níveis de glutationa total nas células leucêmicas estudadas em 4 tempos (0, 24, 48 e 72h) e 4 condições diferenciadas (células; células + WPC; células + WPC + ARAC-C; células + ARA-C). Todos os resultados, tanto do capítulo 3 como do 4, foram analisados através do software ¿Statística: Basic Statistics and Tables¿. Não houve diferença entre o WPC e a caseína em relação aos parâmetros avaliados nos experimentos in vivo, exceto na análise de Doença Residual Mínima (DRM), na qual a caseína se mostrou mais efetiva que o WPC. Constatou-se superioridade do WPC sobre os resultados de peso corporal, razão dos rins e baço pelo peso e evolução da leucemia em relação aos animais tratados com dieta comercial. Não foi possível verificar um efeito sinergístico entre o WPC e o quimioterápico sulfato de vincristina. No que se refere aos experimentos in vitro, o WPC apresentou IC50 para Nalm-6 de 6,72 mg/mL e para a linhagem CEM de 11,84 mg/mL. Verificou-se que as linhagens K562, Nalm-6 e HL-60 apresentaram perfis semelhantes em relação à viabilidade celular. No entanto, em relação à produção de glutationa total, cada linhagem comportou-se de maneira diferenciada, sendo que a maior produção em todas as condições e tempos estudados, foi para a linhagem HL-60 seguida pela K562

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