AnÃlise da expressÃo da β-Xilosidade II da bactÃria aquÃtica Caulobacter crescentus e seu papel no aproveitamento de resÃduos agroindustriais. / Analysis of β-Xylosidase II expression of the aquatic bacterium Caulobacter crescentus and its role in the utilization of agro-industrial residues

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

20/01/2011

RESUMO

Materiais lignocelulÃsicos sÃo abundantes em resÃduos agroindustriais e subprodutos da agroindÃstria e podem ser usados para produÃÃo de combustÃveis e outros quÃmicos de interesse comercial. Uma alternativa aos mÃtodos fÃsicos e quÃmicos para bioconversÃo de material lignocelulÃsico à o uso de enzimas produzidas por micro-organismos. A bactÃria aquÃtica Gram negativa Caulobacter crescentus apresenta potencial biotecnolÃgico para o uso destes resÃduos por conter em seu genoma vÃrios genes que codificam para enzimas envolvidas com o metabolismo de materiais lignocelulÃsicos, incluindo 5 genes para β- Xilosidases. No presente trabalho o gene xynB2 (1,5 kb), que codifica para a β-xilosidade II de C. crescentus, foi clonado no vetor pJet1.2 (Fermentas) e subclonado em fase de leitura nos sÃtios EcoRI/XbaI do vetor de expressÃo pPROEX-HTa (Invitrogen). Uma proteÃna de fusÃo com cauda de histidinas foi obtida apÃs induÃÃo da expressÃo do gene xynB2 em E. coli (DH10B) com IPTG (1mM). A β-xilosidade II recombinante (β-Xil-II-rec) foi purificada por cromatografia usando resina de nÃquel-sepharose e a enzima pura caracterizada quanto a parÃmetros cinÃticos e bioquÃmicos. Uma banda Ãnica de 65 KDa foi obtida em gel SDSPAGE 9% para a β-Xil-rec-II purificada de C. crescentus, a qual mostrou uma atividade especÃfica de 215 U/mg, pH Ãtimo igual a 6, temperatura Ãtima de 55ÂC e meia vida de 4 horas a 50ÂC. ApÃs 24 h de incubaÃÃo em pH 6 a enzima reteve 95% da atividade inicial. A maioria dos Ãons inibiu a atividade de β-xilosidade II, mas um aumento de 32% foi observado na presenÃa de KCl (2mM). Os parÃmetros cinÃticos KM e VMÃx foram iguais a 8,4 mM e 370 moles/min, respectivamente. A capacidade da β-Xilosidase II recombinante pura de C. crescentus hidrolisar xilano e o resÃduo bagaÃo de cana foi avaliada apÃs incubaÃÃo prÃvia destes com a Xilanase purificada de Aspergillus alliaceus. As porcentagens relativas de produtos de hidrÃlise do xilano e bagaÃo de cana-de-aÃÃcar aumentaram 2,5 e 6,5 vezes, respectivamente, apÃs incubaÃÃo por 18 horas com a β-Xil-II-rec pura de C. crescentus, ressaltando assim, a possibilidade de aplicaÃÃo desta enzima em processos biotecnolÃgicos. Em adiÃÃo, a β-Xil-II-rec foi usada para a produÃÃo de um anticorpo policlonal em coelho que mostrou por ensaios de âWestern Blotâ uma elevada especificidade para reconhecimento da proteÃna purificada. Paralelamente, com o objetivo de investigar o papel do gene xynB2 para C. crescentus, dois mutantes foram obtidos. O primeiro foi construÃdo pela inserÃÃo de um cassete de resistÃncia a espectinomicina dentro do gene xynB2 por dupla recombinaÃÃo homÃloga, gerando uma linhagem mutante nula denominada RSJU-2. Os segundo foi obtido por clonagem do gene xynB2 sob o controle de um promotor indutÃvel por xilose gerando uma linhagem denominada pMOA. A atividade de β-Xilosidase foi mensurada nas cÃlulas das linhagens RSJU-2, pMOA e parental (NA1000) de C. crescentus, as quais cresceram na ausÃncia e presenÃa de diferentes resÃduos agroindustriais. A depleÃÃo do gene xynB2 fez as cÃlulas mais hÃbeis a produzirem altas atividades de outras β-Xilosidases na presenÃa de diferentes resÃduos ou fontes de carbono. Estes resultados indicam que a ausÃncia do gene xynB2 regula positivamente a expressÃo de outras β-Xilosidases em C. crescentus. Por outro lado, um decrÃscimo na atividade de β- Xilosidases foi observado na linhagem pMOA, sugerindo que a superexpressÃo da β- XilosidaseII regula negativamente a atividade de β-Xilosidases. Para verificar se a variaÃÃo nos nÃveis de atividade de β-Xilosidase ocorre como um reflexo de variaÃÃes nos nÃveis de transcriÃÃo de genes de β-Xilosidases nas diferentes cepas, foi construÃdo uma fusÃo de transcriÃÃo a partir da clonagem do promotor do gene xynB2 a frente do gene lacZ de E. coli. Assim, foi quantificada a atividade de β-Galactosidase como uma medida da atividade do promotor do gene xynB2, o que demonstrou que gene xynB2 à dependente de transcriÃÃo.

ASSUNTO(S)

caracterizaÃÃo enzimÃtica agroindÃstria â resÃduos cloning purification lignocellulose xylan engenharia agricola

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