Regeneração e infecção por Agrobacterium tumefaciens em explantes de Tabaco(Nicotiana tabacum L.) cv. SR1 / Regeneration and infection mediated by Agrobacterium tumefaciens using explants of tobacco (Nicotiana tabacum L.) cv. SR1

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2005

RESUMO

A moderna biotecnologia molecular permite a produção de várias proteínas recombinantes em diferentes sistemas de expressão. A produção de vacinas em plantas pode representar uma alternativa atrativa, segura e barata ao sistema convencional. Antígenos, como HBsAg de organismos infecciosos como o vírus da hepatite-B podem ser produzidos em plantas transformadas. Um sistema de expressão que usa plantas como biorreator requer elevadas taxas de regeneração e transformação. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um eficiente protocolo de regeneração e transformação visando estabelecer um sistema de expressão para a produção do antígeno de HBsAg. Para isso, foram realizados experimentos para avaliar os fatores que influenciam o processo de regeneração, seleção, assim como, determinar parâmetros de transformação, via Agrobacterium, usando segmentos de folhas e entrenós de Nicotiana tabacum L. cv. SR1. Para regeneração a concentração de cinetina ideal foi de 1,0 mg.L -1 e 2,0 mg.L -1 para entrenós e segmentos de folha, respectivamente. O teste de tolerância a canamicina mostrou ser altamente eficiente, obtendo-se a supressão da regeneração com 50 mg.L -1 e 100 mg.L -1 para segmentos de folhas e entrenós, respectivamente. Apesar do bom desempenho de regeneração dos explantes de folhas nos testes de regeneração, para a transformação via Agrobacterium, entrenós foram significativamente mais eficientes. Além disso, para tabaco cv. SR1 os parâmetros ideais foram o pré-condicionamento por 4 dias em meio de regeneração, os explantes foram colocacados por 10 min em Agrobacterium em meio MS, um co-cultivo de 24 h em meio semi-sólido, a lavagem dos explantes com os antibióticos cefotaxima (100 mg.L -1 ) e tetraciclina (400 mg.L -1 ), sendo essa a combinação de antibióticas menos tóxica. A regeneração, após a transformação deve ser feita sem a presença de canamicina, já que esta inibe a regeneração de gemas. A otimização dos parâmetros de transformação resultou em percentagens de transformação significativamente maiores. Os explantes, calos e primórdios meristemáticos eram quimeras para a atividade da β -glucoronidase, onde se observou explantes sem atividade e outros com forte atividade. Porém, não foi possível confirmar que as plantas transformadas possuíam o T-DNA integrado ao genoma de forma estável, e recomendam-se análises moleculares adicionais para verificar a presença do gene hbsag nas plantas bem como verificar a viabilidade da cepa C58C1 da Agrobacterium para a transformação efetiva de plantas. O sucesso demonstrado para a regeneração e transformação representam um importante avanço estratégico para o uso de plantas como biorreator visando a expressão recombinante do antígeno de HBsAg.

ASSUNTO(S)

biotecnologia proteínas recombinantes nicotiana tabacum proteinas tabaco

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