RasGEF1b: localização celular de seus domínios e papel regulador negativo sobre a ativação de NF-kappaB

AUTOR(ES)

Thalita Marcolan Valverde

FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

29/07/2011

RESUMO

O fator de troca de nucleotídeo guanina, RasGEF1b, representa uma proteína fortemente induzida em resposta à estimulação com agonistas inflamatórios dos receptores do tipo Toll (TLR, do inglês Toll like receptors). Uma vez que RasGEF1b é uma proteína de localização endossômica e de expressão induzida na resposta imune inata mediada por TLRs, tivemos como objetivo inicial avaliar o efeito do ganho-de-função de RasGEF1b e seus domínios sobre a ativação de NF-kB induzida na resposta inflamatória, assim como analisar a distribuição celular. Para isso, ensaios de gene repórter foram realizados e demonstraram que RasGEF1b exibe um efeito regulatório negativo sobre a ativação de NF-kB mediada pelos componentes da via de TLRs, Mal-Tirap e TAK1/TAB1. Para avaliar o efeito dos domínios amino e carboxi-terminal de RasGEF1b sobre a ativação de NF-kB, foi necessário clonar separadamente as regiões codificadoras referentes aos domínios no vetor de expressão eucariótica pFLAG-CMV4. Ensaios de transfecção transiente foram realizados inicialmente em células epiteliais humanas HEK293A. Análises por ensaios de gene repórter demonstraram que os domínios amino e carboxi-terminal de RasGEF1b exibem um efeito regulatório negativo sobre a ativação de NF-kB mediada pelos componentes da via de sinalização de TLRs, Mal-Tirap e TAK1/TAB1, mas não por p65. No entanto, não foram visualizadas diferenças significativas entre os domínios sobre a ativação de NF-kB. Ainda, observamos que RAP2A e/ou a co-transfecção com RasGEF1b exibiram efeito regulatório negativo sobre a ativação de NF-kB, mediada por TNF-. Para analisar a distribuição celular dos domínios de RasGEF1b, as regiões codificadoras referentes aos domínios amino e carboxi-terminal desse GEF foram clonadas no vetor de expressão eucariótica pEGFP-N1. Os resultados por microscopia de fluorescência demonstraram que RasGEF1b-amino-terminal possui localização citoplasmática, com marcação um pouco mais intensa em regiões associadas a membranas celulares. Entretanto, RasGEF1b-carboxi- terminal mostrou distribuição organizada preferencial por núcleo celular, mas com expressão também citoplasmática. Nossos resultados indicam que RasGEF1b exibe um importante efeito sobre a regulação de NF-kB e potencial função na resposta inflamatória

ASSUNTO(S)

biologia celular teses. receptores toll-like decs proteínas g teses. fatores de troca do nucleotídeo guanina decs 

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