Purificação e caracterização estrutural de proteases produzidas pelo fungo entomopatogênico Beauveria bassiana CG432 ativado em insetos broca-do-café

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2008

RESUMO

Beauveria bassiana é um fungo entomopatogênico isolado de insetos mortos na natureza e tem sido amplamente estudado devido a sua capacidade de infectar e matar várias espécies de insetos. Os fungos apresentam uma vantagem em relação a outros entomopatógenos, pois não precisam ser ingeridos para causar a infecção. Conídios infectantes penetram no exoesqueleto do inseto por meio da ação de enzimas hidrolíticas como proteases, quitinases e lipases produzidas em resposta a constituição da cutícula do inseto. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar as proteases extracelulares produzidas pela cepa brasileira de B. Bassiana CG432 previamente reativada em adultos de broca-do-café (Hypothenemus hampei). Para obtenção das proteases, a cepa CG432 foi cultivada em meio líquido basal contendo 1% de glucose, 0,5% de extrato de levedura e inoculadas a 1% com uma suspensão 108 conídios/mL, a 28ºC e 150 rpm. Os cultivos foram interrompidos no terceiro dia. A purificação e caracterização das proteases extracelulares foram realizadas por ultrafiltração e cromatografia de exclusão molecular em gel Sephadex G-100. A atividade das proteases foi determinada em tampão glicina-NaOH 5 mM pH 9,5 por detecção de peptídeos solúveis liberados a 37ºC/30 min sobre soro albumina bovina pelo método de Hartree. O fator de purificação obtido foi de 43, massa molecular de 23 kDa e 26 kDa por meio de eletroforese bidimensional PAGE-SDS, e ponto isoelétrico de 4,5, 56 % de ácido aspártico por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa ODS-C18 e eluente tampão acetato-metanol (38:62). As proteases foram caracterizadas como serino proteases, com resíduos de cisteína, pois foram inibidas por fluoreto fenil-metil-sulfonil e ácido p-cloromercúriobenzóico. As proteases do Pico II apresentaram Km 4x10-4 M sobre substrato tipo-subtilisina.

ASSUNTO(S)

enzimas proteolíticas - purificação beauveria bassiana broca-do-café proteolytic enzymes purification coffee berry borer

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