Purificação e caracterização de hialuronidase da peçonha da caranguejeira Vitalius dubius (Araneae, Theraphosidae) / Purification and characterization of hyaluronidase from venom of the brazilian spider Vitalius dubius (Aranease, Theraphosidae)

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

15/07/2011

RESUMO

A hialuronidase (Hyase) de peçonha contribui para a difusão da peçonha do local da inoculação. Neste trabalho, foi purificada e caracterizada a Hyase da peçonha da Vitalius dubius (Araneae, Theraphosidae), uma aranha caranguejeira encontrada no sudeste do Brasil. A peçonha obtida por estimulação elétrica de machos e fêmeas adultas foi fracionada por cromatografia em gel filtração em uma coluna Superdex 75 (tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 6, contendo 0,15 M de NaCl), a um fluxo de 1 ml/min. O perfil de eluição foi monitorado a 280 nm e frações de 1,5 ml foram coletadas e analisadas para Hyase. As frações ativas foram reunidas e aplicadas em uma coluna de afinidade heparin-Sepharose (em acetato de sódio 0,01 M, pH 6). A coluna foi lavada com o mesmo tampão e as proteínas foram eluídas com um gradiente linear de NaCl (0-1 M). As frações ativas foram agrupadas e avaliadas quanto à pureza por SDS-PAGE e RP-HPLC. O pH ótimo, a estabilidade térmica, a presença das isoformas, e a neutralização por flavonóides e antivenenos comerciais também foram avaliadas. A Hyase foi purificada em duas etapas cromatográficas, com atividade específica de 148 unidades de redução de turbidez (TRU)/mg (peçonha: 36 TRU/mg; fator de purificação de ~ 4). A Hyase apresentou uma massa molecular estimada em 43 kDa por SDS-PAGE, que não foi afetada por ?-mercaptoetanol. Zimografia em gel contendo ácido hialurônico confirmou atividade sobre o substrato. O pH ótimo foi de 4 a 5, com atividade ótima à 37°C. A Hyase manteve estabilidade até 60°C, mas perdeu rapidamente a atividade em altas temperaturas; a atividade se manteve após vários ciclos de congelamento e descongelamento. A atividade enzimática foi totalmente inibida por dois (apigenina e naringina) dos cinco flavonóides testados. A concentração de NaCl (0,05-1 M) não influenciou a atividade. A enzima apresentou maior atividade com ácido hialurônico em relação ao sulfato de condroitina A e foi totalmente neutralizada pelo antiveneno aracnídeo polivalente contra peçonha de aranha-marrom (Loxosceles sp.), aranha armadeira (Phoneutria nigriventer) e escorpião amarelo (Tityus serrulatus), mas não por antivenenos contra peçonha de lagarta (Lonomia obliqua), escorpião (T. serrulatus e Tityus bahiensis) ou serpente (Bothrops, Crotalus e Micrurus). A Hyase aumentou a permeabilidade vascular na pele dorsal de ratos. As propriedades bioquímicas da Hyase foram semelhantes às Hyases encontradas em outras peçonhas. A neutralização pelo antiveneno aracnídeo (mas não pelo escorpiônico) indicou que esta enzima compartilha epítopos antigênicos com enzimas semelhantes em peçonhas de outras aranhas

ASSUNTO(S)

enzimas proteina purificação aranha enzymes purification spider protein

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