Purificação de pro-insulina humana recombinante com cauda de poli(histidina) : cromatografia em membranas de afinidade com ions metalicos imobilizados

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2004

RESUMO

A cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados (IMAC) tem sido uma técnica bastante utilizada para a purificação de proteínas recombinantes que possuem uma cauda de polihistidina acoplada na porção N ou C-terminal. Como alternativa aos géis de agarose (tradicionalmente empregados em IMAC) tem sido proposto o emprego de membranas, cuja vantagem principal é a transferência de massa ser governada principalmente por convecção. Este trabalho investigou o potencial de membranas de fibras ocas de álcool poli( etileno )vinílico (pEV A) com íons metálicos imobilizados para a purificação de pró-insulina recombinante com cauda de poli(histidina) (PIS) a partir de soluções não clarificada (PIS-NC) (obtida após solubilização dos corpos de inclusão e sulfitólise) e clarificada (PIS-C) (obtida após a centrifugação da solução não clarificada). Com este objetivo, experimentos de adsorção foram realizados com fibras finamente cortadas e em módulo de filtração. Inicialmente as membranas de PEV A cortadas foram ativadas e o agente quelante ácido iminodiacético (IDA) foi imobilizado, sendo estas membranas modificadas denominadas PEV A-IDA. A seguir, dentre as membranas PEV AIDA-Me2+ (Me2+ equivalente aos íons CU2+, Ni2+, Zn2+ ou Co2+), PEV A-IDA-Ni2+ e PEV AIDA-CU2+ foram as que apresentaram melhor eficiência para adsorção de pró-insulina (90 e 97% do total de proteína alimentada, respectivamente), sendo então selecionadas para a purificação de PIS a partir das soluções PIS-NC e PIS-C. As membranas PEV A-IDA-Ni2+ apresentaram melhor seletividade e capacidade de adsorção de PIS a partir de PIS-C e PISNC (29 e 26% de PIS adsorvida, respectivamente) do que as membranas PEV A-IDA-Cu2+ (7 e 0% de PIS adsorvida, respectivamente), sendo este adsorvente selecionado para a continuação do trabalho. A adsorção de PIS nas membranas cortadas foi avaliada através da cinética e isoterma de adsorção utilizando, respectivamente, a expressão da taxa de variação da concentração de proteína na fase líquida com o tempo e o modelo de Langmuir. A seguir, foi construído, um módulo de filtração, no qual as membranas foram ativadas e IDA foi imobilizado (protocolos equivalentes aos utilizados para as fibras cortadas). Através de experimentos de filtração, determinou-se curvas de ruptura e a capacidade dinâmica para a adsorção de PIS a partir das soluções PIS-NC e PIS-C. As capacidades de adsorção de próinsulina das fibras cortadas, módulo de filtração e gel foram comparadas. As membranas PEV A-IDA-Ni2+ cortadas e o módulo de filtração apresentaram menor capacidade de adsorção de PIS (4,0 e 4,62 mg/g seca, respectivamente) do que o gel Sepharose-IDA-Ni2+ (12,26 mg/g seco). Visando melhorar o desempenho das membranas de PEV A, estas foram ativadas e um método de polimerização foi utilizado para a imobilização do ligante ácido vinilbenziliminodiacético (VBIDA) nas membranas, sendo após este procedimento, denominadas PEV A-VBIDA As membranas PEV A-VBIDA-Ni2+, apesar de maior densidade de ligantes (148 J.1II1o1 de Ni2+/g seca), demonstraram capacidades de adsorção de PIS de 2,4 e 8,0 vezes menores, quai:1do alimentadas com, respectivamente, soluções PIS-C e PIS-NC, do que PEV A-IDA-Ni2+ (37 !lmol de Ne+/g seca). Contudo, apesar das membranas terem apresentado menor capacidade de adsorção de PIS em relação ao gel, a possibilidade de processar soluções contendo material particulado sem a necessidade de prévia clarificação, tomam este suporte vantajoso para a purificação de proteínas

ASSUNTO(S)

membranas (tecnologia) ions metalicos insulina proteinas - purificação adsorção cromatografia liquida

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