Propriedades bioquímicas e cinético-enzimáticas de serino e cisteíno proteases produzidas por bactérias isoladas do trato intestinal de Anticarsia gemmatalis / Biochemical and kinetic enzymatic properties of serine and cysteine proteases produced by bacteria isolated from intestinal tract of Anticarsia gemmatalis

Franciny Martins Pilon

Inibidores de proteases atuam no mecanismo de defesa de plantas contra infestação de insetos e patógenos. A utilização de genes que codificam inibidores de enzimas digestivas para a obtenção de plantas resistentes ao ataque de insetos é uma estratégia promissora. Porém, para que isso ocorra é importante que a planta expresse uma combinação de inibidores que cubra o espectro total de proteases intestinais. Dessa forma, deve ser considerada a fisiologia do inseto, a bioquímica de sua digestão e a microbiota local. Recentemente foram isoladas diversas bactérias proteolíticas do intestino da lagarta-da-soja, Anticarsia gemmatalis. Todas foram capazes de produzir quantidades significativas de proteases quando cultivadas em meio de cultura adequado. Neste contexto o presente trabalho fundamentou-se em caracterizar as serino e cisteíno proteases provenientes de Bacillus cereus, Staphylococcus xylosus, Enterococcus mundtii e Enterococcus gallinarum, isoladas do trato intestinal de A. gemmatalis. As culturas bacterianas foram inoculadas em meio de cultura infusão cerébro coração(BHI) acrescidos de 0,1% de soro albumina bovina (BSA) mantidas a 37C, a 200 rpm em agitador. Os extratos enzimáticos foram obtidos através de centrifugação das culturas a 10.000 rpm por 20 minutos a 4C. Todas as serino e cisteíno proteases foram capazes de hidrolisar a caseína, e os substratos sintéticos L- BApNA e L-TAME. Verificou-se pronunciada atividade das serino proteases em pH 8,5 para B. cereus, S. xylosus, E. gallinarum, e em pH 7,5 para E. mundtii e temperaturas de maior atividade a 250C para B. cereus, a 300C para S.xylosus e E. mundtii e 350C para E.gallinarum sobre os substratos L- BApNA e L-TAME. Para as cisteíno proteases de todas as bactérias verificou-se maior atividade em pH 7,5 frente os substratos L-BApNA e L-TAME. O efeito da temperatura para as cisteíno proteases bacterianas sobre os substratos LBApNA e L-TAME mostraram maior atividade a 35C para B. cereus e S. xylosus, 25C para E. mundtii e 300C para E. gallinarum. Os valores de KMapp para serino proteases utilizando L-BApNA foram de 0,15 mM, 0,12 mM, 0,14 mM, e 0,26 mM respectivamente, para B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum. Os valores de KMapp determinados nos ensaios com o substrato L-TAME foram de 12,4 M, 48,4 M, 18,2 M e 45,2 M, respectivamente, para B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum. Para cisteíno proteases utilizando L- BApNA os valores de KMapp obtidos foram de 0,67 mM, 0,63 mM, 0,67 mM, e 0,270 mM, respectivamente para B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum, e com substrato L- TAME foram de 0,11 mM, 0,13 mM, 0,12 mM e 0,16 mM respectivamente, para B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum. Na análise do efeito de íons cálcio na atividade proteolítica frente os LBApNA e L-TAME, observou-se que as atividades das serino e cisteíno proteases presentes nos extratos bacterianos aumentaram em presença de CaCl2. O efeito de vários inibidores de proteases também foi avaliado, usando L-BApNA e L-TAME como substratos. Com relação ao efeito da concentração de EDTA, inibidor de metalo proteases e quelante de íons Ca+2, verificou-se uma diminuição na atividade amidásica e esterásica com o aumento da concentração de EDTA na mistura de reação para as serino e cisteíno proteases bacterianas. Os inibidores de serino proteases TLCK (irreversível) e Aprotinina (competitivo) diminuíram significativamente a atividade das serino proteases bacterianas. O inibidor de cisteíno proteases E-64 não influenciou as serino proteases bacterinas, o contrário foi observado para as cisteíno proteases produzidas pelas bactérias, onde ocorreu queda na atividade amidásica e esterásica frente o inibidor E-64. Um aumento de TLCK no meio fez com que a atividade das cisteíno proteases bacterianas diminuísse gradativamente, fato atribuído à reação desse inibidor com resíduo de aminoácido histidina na tríade catalítica de cisteíno proteases. A Aprotinina, não influenciou as cisteíno proteases bacterianas. Pespstatina A, inibidor de aspartil proteases não influenciou as serino nem as cisteíno proteases bacterianas. Assim, os resultados de caracterização cinética e de efeito de inibidores de proteases sobre a atividade das proteases produzidas por B. cereus, S. xylosus, E. mundtii e E. gallinarum concluem que essas bactérias sintetizam e excretam no lúmen intestinal de A. gemmatalis, enzimas da família das serino e cisteíno proteases.

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