Produção, purificação e estudos das caracteristicas bioquimicas de glicosiltransferase de Erwinia sp. D-12 : produção de isomaltulose a partir de sacarose

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DATA DE PUBLICAÇÃO

1998

RESUMO

Trezentas e quatorze linhagens de microrganismos foram isoladas de amostras de mel, flores, frutas, caldo, melaço e mosto de usina de álcool e açúcar e testadas quanto a capacidade de produção de glicosiltransferase, que catalisa a conversão de sacarose em isomaltulose (6-O-8-Dglicopirano sil-D-frutofuranose). A isomaltulose também conhecida como palatinose apresenta baixo potencial cariogênico e tem sido utilizada na produção de balas, gomas de mascar e produtos de confeitaria. A linhagem D-12 produtora de glicosiltransferase foi selecionada e identificada como Erwinia sp. pelas características morfológicas e bioquímicas. Estudou-se a produção, purificação e a caracterização bioquÚ1lica da glicosiltransferase intracelular da linhagem de Erwinia sp. D-12. No estudo da produção de glicosiltransferase de Erwinia sp. D-12, em meio de cultura composto de 6% de sacarose, 6% de peptona e 0,4% de extrato de carne, em fermentador de 2L verificou-se que a enzima é produzida na fase exponencial de crescimento, sendo que a produção máxima foi obtida após 3 horas de fermentação a 28°C e, após 4 horas de incubação a 30°C e 35°C. A enzima foi purificada através da cromatografia em colunas de DEAE-Sephadex A-50 e DEAE-Sepharose CL-6B. A glicosiltransferase purificada apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40ºC. A glicosiltransferase purificada de Erwinia sp. D-12 é termo sensível sendo inativada após 1 hora de tratamento a temperaturas superiores a 39°C e após 3 horas a 35°C na ausência de substrato. A enzima mostrou-se estável na faixa de pH 5,7 a 6,3 após 24 horas de incubação a 5°C. Os valores de Km e Vmáx da enzima purificada foram respectivamente, 138mM de sacarose e 9,81 µmol de isomaltulose/minuto/mg de proteína. A atividade de glicosiltransferase não foi afetada por KCL MgS04, CaCh, NaCI, Na2HAsO4 na concentração 10mM, em relação ao volume final da mistura de reação, enquanto que os sais de CoCh, ZnCh, FeCh e CUSO4 não afetaram sua atividade nas concentrações de O,lmM e 1,0mM. Os sais MnCl2 e Pb(CH3COO)2 na concentração de 0,1mM não inibiram a atividade de glicosiltransferase. A atividade residual de glicosiltransferase na presença de MnCl2, nas concentrações 1mM e 10mM, foi respectivamente 93,0% e 73,7% enquanto que na presença de Pb(CH3COO)2, nestas concentrações, a atividade residual foi 98,3% e 93,3%. O sal BaCl2 não inibiu a atividade da glicosiltransferase na concentração de 0,1mM. O sal AgNO3 inibiu cerca de 37% a atividade de glicosiltransferase na concentração de 0,1mM e inibiu completamente na concentração 1,0mM enquanto que o HgCl2 inibiu completamente a enzima na concentração 1mM em relação ao volume final de reação. Os reagentes ácido etilenodiaminotetracético e L-cisteína nas concentrações 0,1mM, 1,0mM e 10mM em relação ao volume final da mistura de reação não inibiram a atividade de glicosiltransferase. A atividade de glicosiltransferase não foi inibida pelos reagentes azida de sódio e dietilditiocarbamato de sódio nas concentrações 0,1mM e 1,0mM. O reagente p-cloromercuribenzoato inibiu a atividade de glicosiltransferase nas concentrações 0,1mM e 1,0mM e a atividade residual na presença do inibidor foram respectivamente 79,8% e 60,7%. O reagente N-bromosuccinimida inibiu cerca de 6% a atividade de glicosiltransferase na concentração 0,1mM e inibiu completamente a enzima na concentração 1,0mM. A iodoacetamida inibiu a atividade de glicosiltransferase na concentração final 1,0mM e 10,0mM e a atividade na presença do inibidor foram respectivamente 65,5% e 21,3%. O peso molecular da glicosiltransferase purificada da linhagem Erwinia sp. D- 12 foi estimado em 63.000 daltons através da filtração em gel Sephadex G -200. No estudo da aplicação da glicosiltransferase de Erwinia sp. D-12 na conversão de sacarose em isomaltulose utilizando-se solução 5% e 10% de sacarose foram obtidos rendimento de 73,5% e 72,3% de isomaltulose respectivamente, após 4 horas de reação a 40°C

ASSUNTO(S)

erwinia

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