Produção de hidrolases pelo fungo Dicyma pulvinata, e purificação de uma beta glucanase do isolado CEN62

AUTOR(ES)

Daniel Paiva Agustinho

DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

A seringueira (Hevea spp.) é uma planta nativa da região amazônica, da qual se extrai o látex para a fabricação da borracha natural. O Brasil já foi o maior produtor mundial de látex, e este já foi responsável por 40% da exportações brasileiras. Esta planta é suscetível ao ataque do fitopatógeno Microcyclus ulei, causador do mal das folhas da seringueira, que é também endêmico da região amazônica e o principal responsável pela queda de produção de látex na América Latina e perda do mercado para países asiáticos como Sri Lanka e Malásia. Entretanto, surgiu dentro deste contexto o fungo micopatogênico Dicyma pulvinata que apresenta alta capacidade de controle do fitopatógeno M. ulei. Considerando esse fato, D. pulvinata pode ser utilizado como uma ferramenta para o controle biológico do mal das folhas da seringueira. Neste trabalho foi analisada a capacidade de produção de glicosil hidrolases (β−1,3-, β−1,3-1-4- e β−1,4-glucanase e quitinase ) por dois isolados CEN62 e CEN93, que haviam demonstrado, em estudos anteriores, serem bons antagonistas do fitopatógeno M. ulei. Assim, foi iniciado um projeto de avaliação da capacidade de produção dessas enzimas por estes dois isolados, e a caracterização de suas propriedades bioquímico-moleculares. Os dois isolados demonstraram capacidades de produção das enzimas β−1,3-, β−1,3-1,4-glucanase e quitinase. No entanto, apenas o isolado CEN62 apresentou atividade de β-glucanase no sobrenadante do meio de cultura. Nenhum dos dois isolados secretou atividade de quitinase. Entretanto, a atividade de quitinase significativa foi encontrada associada ao micélio. Não foi possível, no entanto, a identificação de moléculas relacionadas a essa atividade, quer seja procedendo a lise do micélio na presença de detergente, quer procedendo a lise por sonicação Assim, foi escolhido o sobrenadante do meio de cultura do isolado CEN62 para etapas posteriores de purificação, por apresentar uma atividade de β−1,3-glucanase. O sobrenadante do meio de cultura do isolado CEN62 foi então caracterizado bioquimicamente, observando-se que a atividade de β−1,3-glucanase teve um máximo a 60C e pH 5,5, e a atividade de β 1,3-1,4-glucanase o máximo foi de 50C e pH 5,5. A β−1,3-glucanase apresentou atividade correspondente a uma meia vida de 10 e 1 minutos a 70C e 80C respectivamente. O sobrenadante do meio de cultura do isolado CEN62 de D. pulvinata , crescido por dez dias em meio contendo quitina como fonte de carbono, apresentando atividade de β-1,3-glucanase, foi ultrafiltrado com uma membrana de exclusão de 30kDa, concentrado e submetido a uma cromatografia de troca iônica em resina S-Sepharose. Essa cromatografia resultou em um pico de proteínas com atividade de β-1,3-glucanase o qual foi em seguida, recromatografado em uma coluna de troca iônica (DEAE-Sepharose). Um novo pico de proteínas com três espécies protéicas foi obtido, conforme mostrado em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes. O rendimento deste processo de purificação parcial desta β-1,3-glucanase foi de 0,023%, e o fator de purificação de 345,3 vezes.

ASSUNTO(S)

dicyma pulvinata microcyclus ulei controle biológico biologia molecular

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