Produção, caracterização e imobilização de Levanascarase de Bacillus subtilis natto de

Bruna Caroline Marques-Gonçalves

A levanasacarase é uma frutosiltransferase de grande interesse biotecnológico por sintetizar levana, um exopolissacarídeo bacteriano formado por unidades de frutose, com potenciais aplicações na área terapêutica e nas indústrias de alimentos, cosméticos e medicamentos. A levanasacarase é produzida por diversos micro-organismos, entre eles o Bacillus subtilis Natto, em presença de sacarose como fonte de carbono. Neste estudo a produção de levanasacarase foi otimizada empregando metodologia de superfície de resposta, avaliando a influência da concentração de sacarose, pH e agitação. A produção de levana foi acompanhada paralelamente e a enzima foi parcialmente caracterizada. A partir da condição otimizada para produção da levanasacarase, novos cultivos foram realizados para avaliar a influência dos sais NaCl, KCl e Na2SO4, em diferentes concentrações, na produção da enzima, na síntese de levana, e no crescimento da biomassa. A influência dos sais NaCl, KCl, ZnCl2, BaCl2, CaCl2, MnCl2, Na2SO4, FeSO4, CuSO4 foi avaliada na atividade da levanasacarase. Foram determinados a temperatura e o pH ótimos da enzima, a estabilidade térmica e a constante de Michaelis-Menten. A levanasacarase foi imobilizada em pasta de carbono e utilizada para a construção de um biossensor, que foi aplicado para detecção de sacarose em refrigerante e suco de abacaxi industrializado. A condição otimizada para a produção da enzima foi 300 g L-1 de sacarose, pH 7,5 e 160 rpm, com atividade de 8,57 UA mL-1. A maior produção de levana observada foi 205,92 g L-1. Os três sais testados na fermentação aumentaram a produção de enzima e de levana e reduziram a proliferação da biomassa; com destaque para o Na2SO4 que aumentou 100% a atividade da enzima, 200% a produção de levana e reduziu em 80% o crescimento do B. subtilis Natto. Dos sais avaliados na atividade enzimática, KCl, ZnCl2 e Na2SO4 foram indutores, NaCl não influenciou a atividade da enzima e os demais sais foram inibidores. O pH e a temperatura ótimos observados foram 6,0 e 50oC, a enzima se demonstrou termoativa e termoestável a 30º e com baixa afinidade pelo substrato sacarose (Km = 313 mM). O pH ótimo da enzima imobilizada foi 6,0, coincidindo com o da forma livre, e o Km aparente (Km ap = 833 mM) indicou redução na afinidade da levanasacarase pela sacarose após a imobilização. A detecção de sacarose em refrigerante e suco de abacaxi foi bem sucedida e os resultados indicaram ser um método comparável ao colorimétrico. Conclui-se que a cepa estudada é uma potencial produtora de levana e que a adição do sal Na2SO4 ao meio de cultivo é favorável para a produção da enzima e da levana, facilitando a sua obtenção, pois reduziu a proliferação da biomassa. Características como termo-estabilidade e termo-atividade tornam interessante a manipulação industrial desta enzima. O biossensor se demonstrou uma alternativa rápida e eficiente para a detecção de sacarose.

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