Padronização e aplicação de técnicas de diagnóstico para o vírus da Língua azul e da doença hemorrágica epizoótica dos cervídeos

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

CAPÍTULO 1 - O vírus da língua azul é um Orbivirustransmitido por um vetor artrópode do gênero Culicoides à ruminantes domésticos e selvagens. Até o momento 24 sorotipos são descritos na literatura. A ocorrência de surtos tem sido relatada em países da Europa como consequência de mudanças climáticas. É economicamente importante por causar doença em ovinos e restrição no trânsito de animais e importação de sêmen bovino. O diagnóstico baseado na técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) é com frequência empregados para sorogrupar amostras de VLA utilizando os segmentos mais conservados do genoma viral (S5, S7 e S10) como alvo. A análise filogenética do segmento NS3 demonstrou que é possível agrupar amostras de VLA provenientes das mesmas regiões geográficas, ano de isolamento e até mesmo tipo de hospedeiro. Devido à escassez de informações sobre os sorotipos de VLA circulantes no Brasil, foram desenhados três iniciadores dirigidos ao gene NS3 do VLA, sendo um externo degenerado, baseado na análise de nucleotídeos de 18 amostras do VLA depositadas no Genbank. Este trabalho teve como objetivo: (i) padronizar um teste de RT-PCR semi-nested para detecção do VLA em amostras de sangue ovino experimentalmente infectadas, (ii) comparar diferentes métodos de extração de ácido nucléico, (iii) testar a eficiência de amplificação de diferentes enzimas DNA polimerase, (iiii) aplicar a técnica padronizada em amostras de sangue de ovinos e caprinos entre 2 e 5 meses coletadas a campo. A quantificação do RNA em amostras extraídas pelo método Trizol foi maior que pelo método fenol-clorofórmio (F:C), kit DNA ou kit RNA. Contudo uma melhor relação DNA/ proteína (260/280) e sensibilidade da PCR frente a amostras diluídas (1:10, 1:50 e 1:250) foi observada pela extração com F:C. Accuprime® e Go Taq®.foram as enzimas com maior especificidade. Go Taq® e Taq Platinum® tiveram os melhores rendimento com a visualização de bandas intensas em amostras positivas com e sem extração. A sensibilidade analítica da PCR empregando-se os iniciadores internos dirigidos a um fragmento do gene NS3, foi de 100 fg de DNA alvo. Sangue de 94 ovinos entre 2 e 5 meses e 41 caprinos foram testados. Todas as amostras de sangue foram negativas na RT-PCR semi-nested, demonstrando que não houve circulação recente do VLA, nos rebanhos pesquisados. CAPÍTULO 2 - O vírus da doença hemorrágica epizoótica (VDHE) e o vírus da língua azul (VLA) são Orbivirus relacionados que infectam ruminantes domésticos e selvagens sem a distinção dos sinais clínicos. Os únicos dados sorológicos sobre VDHE no Brasil são provenientes dos estados do Mato Grosso do Sul e São Paulo, onde a frequência de infecção em ruminantes domésticos e selvagens varia de 39 74%. Sinais clínicos são vistos com maior frequência em algumas espécies de cervídeos susceptíveis. Em fevereiro de 2008 amostras provenientes do Zoológico de Pomerode SC de dois cervos (Mazama gouazoubira e Mazama nana) que morreram com sinais clínicos sugestivos de doença hemorrágica, foram enviadas ao Laboratório de Pesquisa em Virologia Animal para diagnóstico. As lesões observadas foram: cianose e petéquias na mucosa oral, língua e serosas e mucosas do trato gastrointestinal (TGI) em geral, equimoses e petéquias no pericárdio, epicárdio e pulmões. O vírus foi isolado de tecidos de Mazama nana através da inoculação em OEG e monocamada BHK-21. Um fragmento do gene NS3 do VDHE foi amplificado pela RT-PCR semi-nested e em seguida seqüenciado. A análise filogenética demonstrou uma maior similaridade da amostra isolada com amostras dos sorotipos VDHE1 e VDHE2 da América do norte. Esta é a primeira descrição do VDHE isolado no Brasil, causando doença em Mazama nana.

ASSUNTO(S)

doenças transmissiveis em animais teses cervídeo doenças teses veterinária vírus da língua azul teses.

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