Oxide-reduction studies of a protein tyroside phosphatase (CD45) purified from human lymphocytes membranes / Estudo por oxido-redução de uma proteina tirosina fosfatase (CD45) purificada de membrana de linfocitos humanos

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2005

RESUMO

As proteínas tirosina fosfatases (PTP) (EC 3.1.3.48) são enzimas regulatórias chaves que participam na transdução de sinal e são essenciais na regulação do crescimento, diferenciação, ciclos celulares, na transcrição gênica, resposta imune e outros processos. Esta classe de enzimas, que contém cisteína no sítio ativo, pode ser inativada por agentes oxidantes. Neste trabalho, estudamos os efeitos de peróxido de hidrogênio e t-butil hidroperóxido, compostos que induzem estresse oxidativo, na atividade de uma PTP purificada de membranas de linfócitos humanos, indicativamente a CD45. A PTP foi purificada de membranas de linfócitos humanos através de cromatografias de troca iônica (DEAE Sepharose) e exclusão molecular (Sephacryl S-200). A purificação enzimática foi acompanhada por SDS-PAGE e eletroforese bidimensional. A atividade enzimática foi determinada através de incubação a 37°C por 30 min em pH 5,0 em presença de 5 mM de p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato. A enzima obtida da cromatografia de exclusão molecular apresentou uma massa molecular relativa de aproximadamente 200 kDa, reconheceu mais eficientemente tirosina fosfato (cerca de 3,2 vezes) como substrato quando comparado ao pNPP, e foi inibida por inibidores específicos de PTP, tais como vanadato (40%), pervanadato (100%), p-cloromercuribenzoato (20%) and Cu2+ (95%). Ácido okadáico, um inibidor específico de serina e treonina proteína fosfatases, não afetou a atividade da PTP de membranas de linfócitos. Estes resultados de caracterização sugerem fortemente que a PTP purificada de membranas de linfócitos humanos é a CD45. Peróxido de hidrogênio e t-butil hidroperóxido inibiram a atividade dessa proteína com valores de IC50 (concentração do composto que produz 50% de inibição enzimática) de 50 µM e 16 mM, respectivamente. Glutationa reduzida (GSH) protegeu parcialmente a enzima contra estes oxidantes, porém proteções totais foram obtidas quando se adicionava 250 mM de desferoxamina ao meio de ensaio. Nossos resultados sugerem que essa proteína pode ser regulada por alteração do estado de oxidação dos grupos funcionais do sítio ativo e que esta regulação poderia fornecer um mecanismo de controle celular através de espécies reativas de oxigênio

ASSUNTO(S)

proteinas - purificação lymphocytes linfocitos protein-tyrosine phosphatase oxidation-reduction reaction proteina tirosina fosfatase reação de oxidação - redução proteins

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