Otimização do método de detecção do gene PML-RARalfa para PCR quantitativo

AUTOR(ES)

Vasconcellos, Jaíra Ferreira de, Melo, Raul Antônio Morais, Melo, Fárida Coeli Barros Correia, Neves, Washington Batista, Kido, Éderson Akio

FONTE

Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

DATA DE PUBLICAÇÃO

2008-02

RESUMO

O gene híbrido PML-RARalfa é o marcador molecular presente na maioria dos casos de leucemia aguda promielocítica (LAP), sendo útil ao diagnóstico e ao estudo da doença residual mínima. A técnica molecular empregada como rotina laboratorial é a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) qualitativa, porém com o surgimento da PCR em tempo real (Q-PCR), foram descritas abordagens de detecção do gene PML-RARalfa possibilitando a quantificação de transcritos, com a vantagem metodológica da eliminação do processamento pós-PCR. No entanto, os protocolos relatam o uso de sondas fluorescentes de custo elevado para a rotina clínica, limitando sua aplicação. Este estudo teve como objetivo otimizar o método de detecção do gene PML-RARalfa para Q-PCR, utilizando como sistema de marcação fluorescente o intercalante SYBR® Green. A análise foi realizada com cDNA da linhagem celular NB4, tendo sido testados protocolos de termociclagem, síntese de cDNA com primer randômico ou específico e diferentes concentrações de MgCl2 e primers para amplificação. Os resultados mostraram amplificação mais eficiente nas seguintes condições: 2 mM MgCl2, 10 pmol de primers e cDNA sintetizado com primer específico. Não houve diferença na utilização de etapas para anelamento (58°C/30 s) seguido de extensão (72°C/30 s) ou etapa única de anelamento associado à extensão (60°C/45 s). Esses resultados demonstram a otimização da detecção do gene PML-RARalfa para Q-PCR através de um método considerado sensível e de baixo custo para a rotina laboratorial.

ASSUNTO(S)

lap pml-raralfa q-pcr sybr® green

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