Otimização da PCR em tempo real - Sybr Green para detecção do Herpes Vírus Humano tipo 6 (HHV-6)
AUTOR(ES)
Canto, Cynthia Liliane Motta do, Sumita, Laura Massami, Machado, Adriana Freire, Tateno, Adriana, Cunha, Eveline Vieira da, Machado, Clarisse Martins
FONTE
Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo
DATA DE PUBLICAÇÃO
2008-02
RESUMO
HHV-6 é o agente etiológico do Exantema Súbito e considerado a sexta doença mais comum na infância. Em indivíduos imunocomprometidos, a reativação da infecção latente pode causar doença aguda ou morte. Padronizamos PCR em Tempo Real utilizando a química Sybr Green na detecção do HHV-6 e comparamos os resultados com a PCR convencional. Um fragmento de 214 pb foi clonado através do kit pGEM-T do sistema Promega. Com este clone, foram feitas diluições seriadas em um pool de leucócitos negativos a partir de 10-6 ng/µL (equivalente a 2465,8 moleculas/µL) até 10-9 (equivalente a 2,46 moleculas/µL). As diluições foram amplificadas por PCR em Tempo Real utilizando Sybr Green, com primers HHV3 5' TTG TGC GGG TCC GTT CCC ATC ATA 3' e HHV4 5' TCG GGA TAG AAA AAC CTA ATC CCT 3' e pelo método convencional, PCR nested usando primers HHV1 (externo): 5' CAA TGC TTT TCT AGC CGC CTC TTC 3'; HHV2 (externo): 5' ACA TCT ATA ATT TTA GAC GAT CCC 3', HHV3 (interno) e HHV4 (interno): 5' TCG GGA TAG AAA AAC CTA ATC CCT 3'. O limite de detecção foi determinado pelas diluições seriadas do plasmídio contendo um fragmento de HHV6: para o ensaio com Sybr Green, foi de 24,6 moleculas/µL e para a PCR nested, 2,46 moleculas/µL. Elegemos o PCR em Tempo Real - Sybr Green como método diagnóstico e quantitativo do HHV-6 devido a sua boa sensibilidade e menor risco de contaminação.
Documentos Relacionados
- Detecção e monitorização do herpevirus humano tipo 6 (HHV-6) e do citomegalovirus humano (HCMV) em pacientes transplantados hepaticos
- PCR em Tempo Real (qPCR) multiplex utilizando SYBR® Green para a detecção e diferenciação de Bartonella henselae e Bartonella clarridgeiae em gatos
- PCR em tempo real para detecção do vírus da doença de Aujeszky
- Diferentes métodos de PCR em tempo real para detecção do vírus da pseudorraiva
- Detection and molecular caracterisation of human hhv-6 herpesvirus in gengival tissues of pacients affected by periodontal disease.