OtimizaÃÃo das tÃcnicas de manipulaÃÃo genÃtica de leveduras industriais para aplicaÃÃo na produÃÃo de Ãlcool combustÃvel

AUTOR(ES)

Rute Salgues Gueiros

DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

O setor industrial de produÃÃo de Ãlcool combustÃvel, como uma atividade biotecnolÃgica, ainda nÃo experimentou o uso das novas tecnologias de modificaÃÃo genÃtica nas cÃlulas da levedura Saccharomyces cerevisiae, a qual poderia contribuir para o aumento do rendimento de etanol e/ou utilizaÃÃo de fontes alternativas de carbono para o processo fermentativo. Neste trabalho, linhagens industriais de S. cerevisiae previamente selecionadas pela capacidade de permanÃncia no processo industrial foram utilizadas como hospedeiras em experimentos de manipulaÃÃo genÃtica com intuito de modificar o metabolismo redox de forma a aumentar o rendimento a etanol. Entretanto, a constituiÃÃo genÃtica das linhagens industriais requereu que uma sÃrie de adaptaÃÃes aos procedimentos convencionais de manipulaÃÃo genÃtica em linhagens de laboratÃrio fossem otimizadas. O primeiro tipo de atividade consistiu no desenho experimental e no aprimoramento dos procedimentos de deleÃÃo gÃnica baseados na recombinaÃÃo de seqÃÃncias homÃlogas em cassetes de integraÃÃo. Para este fim, o gene GDH1, codificador da enzima glutamato desidrogenase, foi parcial ou completamente removido do genoma da linhagem industrial com o uso de fragmentos de PCR que continham seqÃÃncias com mais de 300 bp de homologia com as regiÃes 5â e 3Â do gene alvo. Este gene codifica a principal enzima da via de assimilaÃÃo de amÃnia e sua remoÃÃo deve causar a substituiÃÃo dos cofatores NADPH por NADH nesta via. Tanto a extensÃo das seqÃÃncias de homologia quanto os tipos de primers de verificaÃÃo da integraÃÃo e da deleÃÃo foram otimizados. A segunda estratÃgia consistiu na inserÃÃo genÃmica por integraÃÃo homÃloga do gene bacteriano GAPN codificador da enzima gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. Ao contrÃrio da enzima da levedura, esta enzima bacteriana utiliza NADPH como cofator, ao invÃs de NADH, e nÃo promove a sÃntese de ATP. O gene bacteriano foi clonado em um plasmÃdeo que apresenta seqÃÃncias das regiÃes 5â e 3â do gene HO de S. cerevisiae e o cassete de integraÃÃo foi utilizado para inserÃÃo no lÃcus HO do genoma da levedura. Para esta atividade, os tipos de primers de verificaÃÃo da integraÃÃo tambÃm foram otimizados. O conjunto de procedimentos experimentais descritos neste trabalho abre oportunidades para futuras manipulaÃÃes genÃticas que possam produzir cÃlulas recombinantes Ãteis para os processos industriais. AlÃm disso, faz-se necessÃria a construÃÃo de vetores de integraÃÃo que permitam a posterior remoÃÃo da marcas de resistÃncia a antibiÃticos, mantendo-se a capacidade de adaptaÃÃo aos ambientes industriais

ASSUNTO(S)

biologia celular e molecular genetic of microorganisms cellular and molecular biology yeasts-saccharomyces cerevisiae alcohol leveduras-saccharomyces cerevisiae genÃtica de microorganismos Ãlcool combustÃvel metabolic engineering engenharia metabÃlica ciencias biologicas

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