Modificações conformacionais da associação entre o SPCI e a a-quimotripsina

Adelson Joel da Silva

"O inibidor de quimotripsina de Schizolobium parahyba (SPCI) pertence à família Kunitz, inibindo especificamente quimotripsina na proporção molar de 1:1 (Ki = 5,85 x 10-8 M). Este trabalho visa analisar as modificações conformacionais resultantes da associação entre o SPCI e a -quimotripsina por meio de métodos espectroscópicos de fluorescência (estacionária e dinâmica), dicroísmo circular e espalhamento de luz dinâmica (ELD); a cristalização do complexo binário SPCI-quimotripsina também foi realizada utilizando o método da matriz esparsa em gota sentada. O SPCI foi purificado pela precipitação com ácido tricloroacético 1,2% seguido por cromatografia de troca catiônica. A purificação do complexo binário foi realizada por cromatografia de exclusão molecular. O espectro da emissão na interação das moléculas apresentou atenuação da intensidade da fluorescência fixa a max = 332. O gráfico de Stern-Volmer apresentou KSV (103 M-1) praticamente constante em diferentes temperaturas, excluindo a hipótese de atenuação estática ou dinâmica. O decaimento de fluorescência do SPCI ( 1 = 0,67 ns e 1 = 0,52; 2 = 4,98 ns e 2 = 0,45) e da -quimotripsina ( 1 = 0,88 ns e 1 = 0,37; 2 = 4,16 ns e 2 = 0,67) foram melhores ajustadas pelo modelo Discreto e Planck para dois tempos de vida baseado no valor mínimo do 2. Os parâmetros obtidos indicam que a -quimotripsina apresenta duas populações distintas de triptofano: enterrada ( 1) e exposta ( 2); o decaimento bi-exponencial encontrado para o SPCI indica subestados conformacionais do triptofano no estado excitado. A interação do inibidor com a quimotripsina foi analisada através da clássica equação de Stern-Volmer. A interação provocou modificações conformacionais nos micro-ambientes dos triptofanos do complexo, aumentando (redução da hidrofobicidade) e atenuando (aumento da hidrofobicidade) o tempo de vida. Essa modificação foi dependente da concentração da enzima. Os cálculos para Kq (1012 M-1s-1) mostraram que a atenuação registrada pela fluorescência estacionária e dinâmica ocorre por ligação molecular. Os experimentos de ELD mostraram que o SPCI apresenta forma monomérica em solução, independente da concentração, pH e temperatura. Portanto, a atenuação do tempo de vida do complexo é devido provavelmente a estados oligoméricos mais complexos (tetrâmero) da enzima. A presença de NaCl 0,2 M reduziram os valores do tempo de vida para ambas as moléculas separadamente, provavelmente pela redução das interações dos triptofanos com os resíduos circunvizinhos. O sal potencializou a atenuação do tempo de vida acima de 20 M da enzima. A análise do papel das ligações dissulfeto na interação também foi realizada. O gráfico de Stern-Volmer mostrou flutuação ao longo da titulação da quimotripsina, sugerindo flexibilidade conformaconal do SPCI nessas condições. A desnaturação térmica do inibidor não foi possível, mostrando que as ligações dissulfeto não são responsáveis pela estabilidade estrutural do inibidor. As reduções dessas ligações promoveram modificações em valores percentuais na estrutura secundária, o que poderá explicar a flexibilidade conformacional registrada na flutuação gráfica de Stern-Volmer. O cristal do complexo binário do SPCI com -quimotripsina difratando a 2,8 Å foi obtido na condição MES/NaOH 100 mM pH 5.5, PEG 6000 20% (w/v), LiCl2 200 mM e sulfobetaína não-detergente 201 (NDSB-201) como aditivo."

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