Microscopia de varredura por sonda aplicada a materiais biologicos

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

Apresentamos nesta dissertação o estudo realizado em cristais de proteínas e membranas modelo (bicamadas lipídicas) utilizando microscopia de força atômica (AFM) como principal técnica de análise. Para os cristais de proteína foram adquiridas imagens topográficas e óticas com a finalidade de obtermos maiores informações sobre o processo de cristalização dos mesmos. No caso das membranas modelo investigamos sua interação com o anestésico local dibucaína (DBC) através de imagens de topografia e fase durante a adição gradual da DBC à solução em contato com a bicamada, além de medidas adicionais de cinética de adsorção e elasticidade. Os cristais de proteína forma preparados pelo método de difusão de vapor em gota posicionada. Para a realização das imagens dos cristais em sua solução de crescimento (altamente viscosa) foi desenvolvida uma metodologia com a finalidade de evitar o amortecimento da vibração da alavanca. Imagens topográficas do cristal de proteína da bactéria patogênica Mycobacterium Tuberculosis) mostraram que a técnica de AFM permite avaliar o grau de ordem cristalina, bem como a existência de defeitos. No cristal da proteína da bactéria Xylella Fastidiosa, foi observada a presença de uma superfície suave com alguns terraços e degraus com altura de aproximadamente 3nm. Também foram observadas formações anisotrópicas na superfície do cristal, em forma de nanofios, sugerindo uma rota diferente de cristalização em condições de baixa concentração de proteína. A partir dessa observação, variamos as condições de crescimento, revelando mudanças significativas nas taxas de crescimento ao longo das diferentes direções do cristal que favoreciam o aumento da anisotropia de forma. As bicamadas lipídicas foram preparadas a partir dos fosfolipídios: fosfatidilcolina de ovo (EPC) e dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) pelo método de fusão de vesículas. Imagens de topografia e fase foram adquiridas por AFM, tanto para caracterização topográfica, bem como para observação da ação da DBC (adicionada gradualmente durante a aquisição) sobre a bicamada. As imagens AFM mostram que as bicamadas EPC se formam em domínios sobre a mica e não apresentam um formato típico nem distribuição uniforme. Por outro lado, bicamadas de DMPC se formam em domínios extensos com multi camadas e de maneira mais homogênea quando comparadas com as bicamadas de EPC. No caso da EPC, observamos a ação da DBC em função do aumento de sua concentração e ao longo do tempo. A seqüência de imagens topográficas mostra o desaparecimento de arranjos lipídicos com o aumento da concentração de DBC. Também observamos que para concentrações elevadas (5mM) o efeito da DBC na membrana é muito drástico. Já para bicamadas de DMPC, observamos as alterações morfológicas para única concentração de DBC (5mM) ao longo do tempo. Neste caso, apesar da concentração elevada, o desaparecimento das bicamadas ocorreu lentamente em comparação com as bicamadas de EPC. Em ambos os casos, as imagens de fase mostram alterações na superfície da bicamada, indicando a alterações nas propriedades elásticas da bicamada na presença de DBC. Medidas de cinética de adsorção e elasticidade superficiais em monocamadas destes lipídios na presença de DBC pelo método de gota pendente corroboram esta hipótese

ASSUNTO(S)

biomembrane adsorption kinetics microscopia de força atomica dibucaina local anesthetic atomic force microscopy anestesico local cinetica de adsorção biomembranas elasticidade elasticity

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