Isolamento e caracterização de células progenitoras endoteliais de medula óssea de camundongos para utilização em terapia celular / Isolation and characterization of endothelial progenitor cells derived from bone marrow of mice for use in cell therapy

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

13/04/2011

RESUMO

As células progenitoras endoteliais (CPEs) foram descritas por Asahara et al. (1997), isoladas a partir do sangue periférico e são células originadas da medula óssea. Estas células podem ser reconhecidas pela expressão de marcadores como o CD34, CD133, VEGFR2 e o CD31, pela capacidade de internalização de acLDL e de formar estruturas semelhantes a vasos quando cultivas em matrizes tridimensionais. Quando ocorrem lesões endoteliais, elas podem ser mobilizadas da medula migrando para o sangue periférico e atuar no local da lesão arterial, podendo se diferenciar em células endoteliais maduras e promover a re-endotelização do vaso lesionado. Contudo, estas células estão presentes na medula óssea e no sangue periférico em quantidade muito pequena, 0,1 e 0,01% do total de células respectivamente, o que leva diversos grupos de pesquisa buscarem selecionar e cultivar estas CPEs visando aumentar seu número para melhor caracterizá-las in vitro e in vivo. Em nosso trabalho, buscamos estabelecer um meio de cultura capaz de sustentar o crescimento, proliferação e diferenciação das células progenitoras endoteliais isoladas a partir de medula óssea de camundongos C57bl/6, e de caracterizar seus vários estágios de diferenciação destas células em diferentes tempos de cultura. Para tal, células mononucleares foram isoladas da medula de camundongos C57bl/6 por gradiente de Ficoll-Paque PLUS e cultivadas por 3, 7 e 14 dias em meios de cultura diferentes acrescidos de diferentes fatores de crescimento (VEGF, IGF, bFGF e EGF) com concentrações variadas. Dentre todos os meios testados, o DMEM1-M1 (DMEM com vermelho de fenol acrescido de VEGF, IGF e bFGF) foi o que apresentou melhores resultados para os ensaios de proliferação, de viabilidade celular por DAPI, Azul de Tripan e MTT. A partir deste meio foram realizados testes para verificar a expressão de marcadores celulares (CD133, CD34, VEGFR-2 e CD31) por imunocitoquímica, imunofluorescência, Western Blotting e citometria de fluxo. Os resultados de imunocitoquímica e imunofluorescência foram positivos para todos os marcadores, em todos os períodos analisados. A análise por Western Blotting confirmou a expressão destes marcadores, com aumento na expressão de 3 para 7 dias de cultura. Por citometria de fluxo analisamos o perfil destas células em cultura de 7 dias comparando com as células in vivo, e conseguimos visualizar um aumento principalmente na freqüência de células que expressam VEGFR-2, um indicativo de que o meio utilizado está selecionando células progenitoras. A internalização de acLDL que também indica CPEs foi positiva após 7 e 14 dias. As células cultivadas em Matrigel® formaram estruturas semelhantes a vasos após 7 dias de cultura. Nossos resultados indicam que fomos capazes de estabelecer um meio de cultura eficiente na seleção e proliferação de CPEs, inibindo sua diferenciação inicial em células endoteliais, o que nos permitirá utilizar esta técnica de cultura para expandir o número de CPEs obtidas da medula óssea e poder utilizá-las no tratamento de lesões arteriais e em diferentes processos de terapia celular.

ASSUNTO(S)

células endoteliais cultura celular proliferação celular meios de cultura (biologia) endothelial cells cell culture cellular proliferation culture medium

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