Inibidores protéicos e seu potencial uso no controle de insetos-praga de importância para a cultura do café e do feijão

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2005

RESUMO

Os inibidores de ?-amilase e de proteinases vegetais tem sido amplamente estudados, devido ao papel destes fatores de resistência contra insetos-praga. Este trabalho tem como objetivo identificar inibidores de ?-amilase e de proteinases, presentes em sementes de Phaseolus coccineus e sementes de algaroba (Prosopis juliflora), com potencial inseticida no controle da broca-do-café (Hypothenemus hampei) e de pragas de grãos armazenados de feijão Acanthoscelides obtectus e Callosobruchus maculatus. Um gene que codifica para o inibidor de ?-amilase de 223 resíduos de aminoácidos, denominado aAI-Pc1 foi clonado de sementes de Phaseolus coccineus, acesso 35590. aAI-Pc1 tem 70 a 98% de identidade de aminoácidos com outros inibidores de ?-amilases de feijão, já descritos. Uma construção contendo o gene aAI-Pc1, regulado pelo promoter da fitohemaglutinina PHA-L, foi introduzida em plantas de fumo, via Agrobacterium tumefasciens. A presença e expressão do gene aAI-Pc1 em plantas transformadas (parental T0 e geração T1) foi confirmada por determinada por PCR, Western blot e ELISA. Extrato protéico das sementes de plantas transformadas selecionadas reagiram positivamente com o anticorpo policlonal contra o anticorpo ?AI-1, enquanto que nenhuma reação foi observada em plantas não transformadas. Ensaios imunológicos mostraram que aAI-Pc1 representa cerca de 0,05% da proteína solúvel total de sementes de plantas (T0). A proteína recombinante expressa em plantas de fumo foi biologicamente ativa, cerca de 125 ng de inibidor aAI-Pc1 mostrou inibir 65% da atividade da ?-amilase de H. hampei. Estes resultados sugerem que o inibidor aAI-Pc1 pode ser um candidato promissor para a obtenção de plantas de café resistentes à broca-do-café. A broca-do-café, H. hampei (Ferrari) é a praga de maior importância para o café do mundo. Atividades de tripsina e quimotripsina presentes no intestino de larva de H. hampei podem ser inativadas na presença de inibidores. Assim, inibidor de proteinase serínica pertencente à classe Bowman-Birk, foi purificado de acesso selvagem de sementes de P. coccineus. O inibidor, nomeado de PcBBI1, é uma proteína rica em cisteína e estável ao calor em pH alcalino. Análises por MALDI-TOF/MS mostraram que o inibidor PcBBI1 se apresenta na forma de um monômero de 8.689 Da ou de um dímero de 17.378 Da. O efeito inibitório de PcBBI1 foi analisado por ensaio in vitro para tripsina e quimotripsina pancreática bovina e para proteinases digestivas de larvas de H. hampei. O inibidor foi fortemente ativo conta as enzimas semelhantes à tripsina de H. hampei, inibindo 80% da atividade proteolítica. Este novo inibidor, PcBBI1, representa uma proteína promissora com potencial aplicação em Biotecnologia de plantas via engenharia genética, visando resistência a broca do café. Um inibidor de proteinase com alta atividade contra a papaína foi isolado de sementes de algaroba (Prosopis juliflora). O inibidor de proteinase Pj foi purificado usando uma coluna de filtração molecular Sephacryl S-200 seguido por uma coluna de fase-reversa líquida de alta pressão Vydac 18 TP. O inibidor Pj mostrou uma massa molecular de 20.000 Da por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e massa molecular de 19.276 Da por espectrometria de massa. A inibição da papaína pelo inibidor Pj foi do tipo não-competitivo, com um valor de Ki de 0.59 x 10-9. A atividade gelatinásica da papaína também foi fortemente inibida pelo inibidor Pj. A seqüência de aminoácidos da extremidade N-terminal do inibidor Pj mostrou homologia com a seqüência de aminoácidos da extremidade N-terminal de inibidores de proteinase da família Kunitz. Pj foi fortemente efetivo contra proteinases digestivas do gorgulho do feijão Acanthoscelides obtectus e do gorgulho de caupi Callosobruchus maculatus e foi moderadamente ativo contra proteinases digestivas do gorgulho da vagem Mimosestes mimosae e do gorgulho do feijão comum Zabrotes subfasciatus. Os dados aqui mostrados sugerem que a proteína presen

ASSUNTO(S)

feijão cafés proteínas - análise pragas - controle bioquímica biologia molecular

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