Implementation and standardization of enzymatic activity techniques for lysosomal storage disease diagnosis. / Implementação e padronização de técnicas de dosagem enzimática para detecção de doenças de depósito lisossômico.
AUTOR(ES)
Karen Barbosa Müller
DATA DE PUBLICAÇÃO
2009
RESUMO
Objetivo: Implementar e padronizar técnicas de dosagem de atividade enzimática em gota seca de sangue em papel de filtro para as seguintes enzimas lisossomais: - galactosidase A, que permite diagnosticar pacientes com Doença de Fabry, - iduronidase, que permite identificar pacientes com Mucopolissacaridose tipo I; - glicosidase e quitotriosidase, que permitem diagnosticar pacientes com Doença de Gaucher e -glicosidase, que permite identificar pacientes com Doença de Pompe, além da enzima -galactosidase, que possibilita avaliar a qualidade do material. Determinar o valor de corte para todas estas enzimas, que irá possibilitar a diferenciação dos indivíduos saudáveis dos pacientes. Metodologia: Ao todo foram selecionados 302 indivíduos, de ambos os sexos e com idades entre 18 e 82 anos. Foram coletados de 5 a 10 mL de sangue periférico de cada voluntário, e posteriormente 4 ou 5 gotas de sangue foram transferidas com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur para um papel de filtro. Todas as técnicas de dosagem de atividade enzimática realizadas neste trabalho baseiam-se na ação da enzima de interesse sobre um substrato sintético específico, que libera após clivagem uma molécula que emite fluorescência. A atividade enzimática será proporcional à quantidade de fluorescência detectada pelo equipamento. Resultados: Com as dosagens de atividade enzimática realizadas neste trabalho foram obtidos os seguintes resultados (médiadesvio-padrão; valores mínimos e máximos), expressos em μmol/L/h: -galactosidase (14,094,36; 4,04-29,65); -galactosidase A (4,571,37; 1,44-10,67); -iduronidase (3,451,21; 1,40-7,78); -glicosidase (4,571,37; 1,44-10,67); quitotriosidase (12,889,84; 0,00- 48,07); -glicosidase (5,411,74; 2,10-10,65); também expressa pela razão - glicosidase neutra/ -glicosidase ácida inibida (13,194,26; 5,03-28,58); e pela por cento inibição da -glicosidase ácida (70,667,60; 36,38-87,08). Os cálculos de sensibilidade e especificidade, realizados confrontando a técnica que utiliza papel de filtro com a técnica que utiliza leucócitos, resultaram em valores acima de 50 por cento, que são considerados adequados. Conclusões: As análises estatísticas dos resultados obtidos possibilitaram a escolha do valor de corte mais preciso, o que permite a diferenciação entre indivíduos saudáveis e pacientes com Doença de Fabry, Doença de Pompe, Doença de Gaucher e Mucopolissacaridose tipo I. Os valores de atividade enzimática observados se mostraram de acordo com os descritos na literatura, com pequenas variações. As técnicas de diagnóstico que utilizam papel de filtro podem ser consideradas uma ferramenta eficiente, barata e simples de serem realizadas. Objetivo: Implementar e padronizar técnicas de dosagem de atividade enzimática em gota seca de sangue em papel de filtro para as seguintes enzimas lisossomais: - galactosidase A, que permite diagnosticar pacientes com Doença de Fabry, - iduronidase, que permite identificar pacientes com Mucopolissacaridose tipo I; - glicosidase e quitotriosidase, que permitem diagnosticar pacientes com Doença de Gaucher e -glicosidase, que permite identificar pacientes com Doença de Pompe, além da enzima -galactosidase, que possibilita avaliar a qualidade do material. Determinar o valor de corte para todas estas enzimas, que irá possibilitar a diferenciação dos indivíduos saudáveis dos pacientes. Metodologia: Ao todo foram selecionados 302 indivíduos, de ambos os sexos e com idades entre 18 e 82 anos. Foram coletados de 5 a 10 mL de sangue periférico de cada voluntário, e posteriormente 4 ou 5 gotas de sangue foram transferidas com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur para um papel de filtro. Todas as técnicas de dosagem de atividade enzimática realizadas neste trabalho baseiam-se na ação da enzima de interesse sobre um substrato sintético específico, que libera após clivagem uma molécula que emite fluorescência. A atividade enzimática será proporcional à quantidade de fluorescência detectada pelo equipamento. Resultados: Com as dosagens de atividade enzimática realizadas neste trabalho foram obtidos os seguintes resultados (médiadesvio-padrão; valores mínimos e máximos), expressos em μmol/L/h: -galactosidase (14,094,36; 4,04-29,65); -galactosidase A (4,571,37; 1,44-10,67); -iduronidase (3,451,21; 1,40-7,78); -glicosidase (4,571,37; 1,44-10,67); quitotriosidase (12,889,84; 0,00- 48,07); -glicosidase (5,411,74; 2,10-10,65); também expressa pela razão - glicosidase neutra/ -glicosidase ácida inibida (13,194,26; 5,03-28,58); e pela por cento inibição da -glicosidase ácida (70,667,60; 36,38-87,08). Os cálculos de sensibilidade e especificidade, realizados confrontando a técnica que utiliza papel de filtro com a técnica que utiliza leucócitos, resultaram em valores acima de 50 por cento, que são considerados adequados. Conclusões: As análises estatísticas dos resultados obtidos possibilitaram a escolha do valor de corte mais preciso, o que permite a diferenciação entre indivíduos saudáveis e pacientes com Doença de Fabry, Doença de Pompe, Doença de Gaucher e Mucopolissacaridose tipo I. Os valores de atividade enzimática observados se mostraram de acordo com os descritos na literatura, com pequenas variações. As técnicas de diagnóstico que utilizam papel de filtro podem ser consideradas uma ferramenta eficiente, barata e simples de serem realizadas.
ASSUNTO(S)
1. diagnóstico. 2. gota de sangue em papel de filtro. 3. doença de gaucher. 4. doença de fabry. 5. doença de pompe. 6. mucopolissacaridose tipo i. pediatria
