Identificação de peptídeos antimicrobianos de folhas de berinjela para o controle de patógenos de plantas / Identification of antimicrobial peptides of leaves of eggplant to control plant pathogen growth.

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são produzidos por animais, plantas, insetos e outros organismos como estratégia de defesa eficiente, flexível e com um baixo consumo de energia e biomassa, em função de seu pequeno tamanho. Em vegetais, foram identificadas dez famílias de AMPs que participam da barreira constitutiva de defesa da planta, com massas moleculares que variam de 2 a 9 kDa. Considerando a importância dos AMPs como possíveis princípios ativos para o desenvolvimento de agentes de defesa, tanto com aplicações farmacêuticas quanto para o desenvolvimento de novas classes de defensivos para a agroindústria, o objetivo desse trabalho foi detectar, extrair e purificar formas de AMPs presentes em plantas jovens e folhas totalmente expandidas de berinjela, e avaliar a ação desses peptídeos in vitro e in vivo contra fitopatógenos de interesse comercial, visando posterior clonagem e expressão heteróloga para caracterização estrutural das moléculas. O trabalho teve ainda o objetivo de explorar o potencial antimicrobiano dos extratos parcialmente purificados, obtidos de plantas jovens e folhas totalmente expandidas de berinjela, visando possível aplicação biotecnológica no controle de fitopatógenos. Folhas de plantas com 60 dias e plântulas inteiras de berinjela (5 ou 15 cm) foram trituradas, maceradas (tampão Tris-HCl, EDTA, PMSF, benzamidina e tiouréia), o extrato foi centrifugado e o sobrenadante correspondeu ao Extrato Solúvel (ES). O precipitado foi lavado (água), extraído em LiCl (EDTA, PMSF, benzamidina e tiouréia), o homogenato foi centrifugado e o sobrenadante correspondeu ao Extrato de Parede Celular (EP). EP e ES dos três estádios de desenvolvimento foram fracionados (por sulfato de amônio e aquecimento), dessalinizados, liofilizados e separados por troca aniônica em DEAE-Sepharose-FPLC. Foram obtidos dois picos catiônicos (PC1 e PC2) e um aniônico (PA) para cada estádio, que foram submetidos a testes de inibição do crescimento das bactérias Ralstonia solanacearum e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Resultados indicaram maior inibição pelos EP obtidos das plantas mais jovens (5 cm), enquanto que para as plantas maduras (15 cm e folhas), ES foi mais ativo. ES de folhas maduras foi também submetido à cromatografia de troca aniônica em coluna Q-Sepharose-FPLC e os cinco pools obtidos foram submetidos a testes antibacterianos, e PC1 foi submetido a teste de inativação ou morte de fitonematóides. PC1 mostrou-se promissor para a bioprospecção de AMPs, por apresentar tanto atividade antibacteriana quanto nematicida contra Meloidogyne incognita, e foi então separado em C18- RP-HPLC. Dos picos coletados, doze foram analisados por espectrometria de massa e dois deles (picos 18 e 24) apresentaram peptídeos com massas entre 2 e 9 kDa. O restante de ES e EP de folhas maduras foi separado em Sephadex G-10, quando foram obtidos quatro pools, tanto para ES quanto para EP, que foram submetidos a testes antibacterianos, tanto in vitro para as duas bactérias fitopatogênicas acima citadas, quanto in vivo para Ralstonia solanacearum em tomateiros. Alguns pools mostraram-se promissores, principalmente o ES-pool 1 obtido após a separação em Sephadex G-10, do qual duas frações foram separadas em C18-RP-HPLC e os picos submetidos à espectrometria de massa. Foram identificadas moléculas com massa molecular na região peptídica de interesse. Os peptídios presentes nas frações dos picos 9 e 14 tiveram suas seqüências aminoacídicas determinadas, que precisam ser confirmadas. Outros picos peptídicos serão submetidos a análises de espectrometria de massa, seqüenciamento e testes antimicrobianos, visando selecionar peptídeos efetivos contra fitopatógenos de interesse.

ASSUNTO(S)

defesa de plantas peptídeos antimicrobianos berinjela proteinas plant defense eggplant antimicrobial peptides

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