Heparinases: Clonagem, Expressão e Requisitos Estruturais para a Atividade. / Heparinases: Cloning, Expression and Structural Requirements for Activity.

AUTOR(ES)
FONTE

IBICT - Instituto Brasileiro de Informação em Ciência e Tecnologia

DATA DE PUBLICAÇÃO

27/04/2011

RESUMO

Características estruturais de heparina (Hep) e heparam sulfato (HS) têm sido determinadas usando enzima de Flavobacterium heparinum, uma bactéria de solo, não-patogênica. Sob indução com Hep/HS ou seus dissacarídeos como única fonte de carbono e nitrogênio, a bactéria sintetiza heparinase e heparitinases I e II. Essas liases clivam heparina e HS por um processo - eliminativo em um padrão endolítico aleatório. Heparitinase I cliva exclusivamente ligações -D-glucosamina N-acetilada ou N-sulfatada (14) β- D-glucuronato de HS/Hep sem haver substituição de sulfato em C6; Heparitinase II cliva ligações -D-glucosamina N-acetil-6-sulfato ou N-sulfato ou N,6-sulfato (14) β-D-glucuronato ou -L- iduronato de HS/Hep, sem haver substituição de sulfato em C3. Heparinase cliva uma -D-glucosamina N- e 6- sulfato (14) -L- iduronato 2-sulfato, presente em heparina. Este trabalho objetiva clonar e expressar heparinase e heparitinase I e estudar o comportamento cinético da heparinase. As enzimas recombinantes foram expressas em E. coli usando o sistema de expressão pET T7 polimerase. O trabalho mostrou que o complexo heparina-Ca2+-heparinase é o substrato verdadeiro para heparinase (KS = 1.40.1μM), enquanto que tanto a heparina livre de Ca2+ (KI= 122μM) como também um importante contaminante farmacêutico de heparina comercial, condroitim sulfato super sulfatado (OSCS) (KI= 0.65μM) são inibidores competitivos. Os valores de pKa dos grupos prototrópicos do sítio ativo foram determinados pela medida pH-, solvente- e temperatura-dependente sobre as contantes kcat/KS, kcat e KS. Os resultados mostram, em pHótimo=6.670.05, um resíduo de histidina desprotonada iniciando a reação de -eliminação pela abstração do próton de C5 do resíduo -L-iduronato 2-O-sulfato; e um resíduo de tirosina na forma protonada agindo como um doador de próton para o anel de hexosamina liberada. Mutações dos residues de histidina 165 e glutamina 163 foram realizadas e análises cinéticas mostraram a manutenção da atividade específica (5,0 e-007 Abs/μg.s), sugerindo que os resíduos H165 e Q163 não são essenciais para a atividade da heparinase.

ASSUNTO(S)

heparinase heparina enzima clonagem biologia molecular

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