Functional and structural characterization of nucleotidase SurE from Xyllela fastidiosa / Caracterização funcional e estrutural da nucleotidase SurE de Xyllela fastidiosa

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

A linhagem 9a5c da bactéria Xylella fastidiosa foi o primeiro fitopatógeno a ter seu genoma completamente sequenciado, o qual gerdu diversas informações sobre seu metabolismo e patogenicidade. Das orfs codificadas por esta bactéria, destaca-se; no presente trabalho, a XF0703, cuja proteína correlata (com 28,3 kDa) possui similaridade com proteínas SurE de várias outras bactérias. Proteínas SurEs são nucleotidases que desfosforilam diversos nucleosideos monofosforilados para seus respectivos nucleosideos. Tal função é de fundamental importância para manter o pool balanceado dos quatro (deoxi)ribonucleosideos para síntese de DNA e RNA, respectivamente. Este trabalho descreve a clonagem da orfXF0703 no vetor pET29a, a expressão da proteína recombinante (XfSurE) em Escheríchia coli BL21(DE3) e a purificação da mesma por cromatografia de afinidade ao níquel. A análise da estrutura secundária foi feita por dicroísmo circular e realizou-se a determinação do estado oligomérico por cromatografia de gel filtração e espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS), os quais revelaram que a proteína é um tetrâmero. Dados de caracterização funcional indicam que a proteína possui maior atividade em pH neutro na presença do íon manganês como cofator, com uma maior afinidade pelo substrato 3 -AMP (K0,5=0,16 mM). Além disso, ensaios cinéticos mostram que a proteína possui um comportamento alostérico com alta cooperatividade positiva (coeficiente de Hill em torno de 2,6) com todos os quatro substratos naturais testados (3 -AMP, 5 -dAMP, 5 -AMP e 5-GMP). Experimentos com a técnica de SAXS permitiram calcular o raio de giro (32,7 ± 0.2 A), distância máxima intramolecular (100 A) e a simetria do envelope da molécula (222). A estrutura de diversas SurEs homólogas já cristalizadas foram superpostas ao envelope obtido, sendo que StSurE (SurE de Salmonella com maior idenjidade de aminoácidos) mostrou ter o melhor ajuste. No entanto, notou-se que havia espaços vazios no envelope de XfSurE e tais espaços podiam ser preenchidos a partir do afastamento das alças responsáveis pela tetramerização e pela rotação dos f dímeros. Estes movimentos (translação e rotação) podem explicar o comportamento alostérico da proteína, facilitando a entrada de substrato ao sítio catalítico da molécula

ASSUNTO(S)

nucleotidase nucleosideos - metabolismo enzyme kinetics allosteric regulation cinetica de enzimas regulação alosterica nucleosides xylella fastidiosa

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