Expressão, purificação e caracterização parcial de proteínas relacionadas à patogenicidade de Magnaporthe grisea / Expression, purification and partial characterization of proteins related to the pathogenicity of Magnaporthe grisea

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2010

RESUMO

A brusone do arroz (rice blast disease) causada pelo ascomiceto fitopatógeno Magnaporthe grisea continua a ter um enorme impacto nas culturas de arroz (Oryza sativa) no Brasil e no mundo. PWL2, uma proteína efetora, é um conhecido produto de um gene AVR (avirulência). O gene PWL2 impede que o fungo infecte weeping lovegrass (Eragrostis curvula). Neste trabalho nós identificamos em uma linhagem de M. grisea um gene que produz uma proteína diferente de PWL2, denominada PWL2D. A seqüência do gene PWL2D tem duas bases que diferem do gene PWL2, as quais produzem alterações nos resíduos de 90 e 142 da proteína. A alteração do resíduo 90 (de D90 para N90) é fundamental para a avirulência. Neste trabalho foram efetuadas a clonagem do gene PWL2D no vetor pET32-Xa/LIC, a expressão em Escherichia coli e a avaliação da estrutura de PWL2D por técnicas espectroscópicas. A proteína PWL2D fusionada à cauda TRX é propensa a agregação, e sua solubilidade é melhorada quando super-expressa sem o seu peptídeo-sinal original. Os resultados estruturais obtidos indicam que a proteína PWL2D possivelmente é intrinsecamente desordenada. Foi elaborado um modelo para a resistência/susceptibilidade do hospedeiro à M. grisea considerando a atuação de PWL2D como uma proteína intrinsecamente desordenada. Os resultados obtidos deverão facilitar a análise estrutural de PWL2D e podem contribuir para a compreensão da função do gene nas interações fungo / planta. Oito diferentes genes de M. grisea, além de PWL2D, foram também estudados neste trabalho. Dentre estes, destacam-se o gene que produz a xilanase XYL5 e seu domínio catalítico, o gene que codifica a chaperona ABC1 e seus dois domínios funcionais, e o gene que codifica a trealase PTH9, sendo todos estes relacionados à patogenicidade do fungo M. grisea. A xilanase XYL5 (EC 3.2.1.8) e seu domínio catalítico conservado (XYL5/DOM) foram fusionados à Maltose Binding Protein (MBP) ou à tiorredoxina (TRX) e expressas em E. coli. A produção de proteína solúvel e ativa foi influenciada pelo tipo de fusão. Os extratos solúveis contendo as proteínas de fusão MBP-XYL5 e MBP-XYL5/DOM apresentaram atividade xilanolítica em relação ao controle. Entretanto, durante o processo de purificação, a atividade foi perdida. Assim, obteve-se pela primeira vez o gene de patogenicidade XYL5 de M. grisea expresso com sucesso em E. coli e sua atividade enzimática xilanolítica foi demonstrada. Não foi possível expressar a chaperona ABC1 na forma solúvel nos sistemas de expressão utilizados, e a sequência gênica referente à trealase PTH9 - por mostrar a presença de introns após o seqüenciamento do gene amplificado na linhagem de M. grisea em estudo, mostrou-se inadequado para a sua expressão protéica no sistema de expressão procariótico utilizado durante a realização deste trabalho

ASSUNTO(S)

magnaporthe grisea patogenicidade xilanases magnaporthe grisea pathogenicity xylanases

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