Expressão heteróloga, purificação e estudo de atividade de uma proteína inibidora de cisteínio protease da cana-de-açúcar e posterior evolução in vitro pela técnica de DNA Shuffling.

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2004

RESUMO

As plantas parecem ter desenvolvido ao longo da evolução mecanismos naturais de defesa contra fungos e insetos. Entre eles está o uso de inibidores de protease. Cistatinas são proteínas que inibem especificamente cisteíno proteases. Elas ocorrem naturalmente em várias espécies de vegetais e acredita-se que elas estejam envolvidas com mecanismos de defesa da planta contra o ataque de patógenos. O gene da Canacistatina que codifica uma proteína contendo106 resíduos de aminoácidos, foi identificado em cana-de-açúcar e possui significante similaridade de sequência com a Orizacistatina I, uma cistatina de arroz. A proteína recombinante foi expressa em E.coli na forma solúvel, o que possibilitou sua purificação direta por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A proteína purificada foi analisada por Dicroísmo Circular que apresentou uma estrutura secundária estimada similar a proteína Orizacistatina I. Além disso, a proteína foi submetida a ensaios de cristalização e foi possível a formação de cristais protéicos, os quais serão utilizados para futuros estudos de cristalografia de Raio-X. A canacistatina foi utilizada com sucesso em testes de inibição de crescimento do fungo Trichoderma reesei. A dose mínima inibitória foi em torno de 50 g/ml. A canacistatina recombinante também foi capaz de inibir o crescimento de fungos patogênicos incluindo Colletotrichum sp P25, Colletotrichum sp P28, Colletotrichum sp P10, Fusarium moniliforme e Aspergillus niger. A inibição mais eficiente foi obtida contra Colletotrichum sp P10 (32.25g/ml). Para obtenção de uma cistatina com atividade melhorada, ensaios de evolução direta foram realizados. Uma biblioteca de shuffling foi construída utilizando duas cistatinas diferentes, a Canacistatina e a Orizacistatina I. Um clone formado por estas duas proteínas foi selecionado. Este clone foi expresso, purificado e submetido a testes de atividade e os resultados demostraram que a atividade do mutante aumentou e este inibe a atividade da catepsina B. Nossos resultados abrem perspectivas para o uso desta proteína como um fingicida natural e para o desenvolvimento de variedades mais resistentes de cana-de-açúcar.

ASSUNTO(S)

cana-de-açucar cancistatina genetica molecular e de microorganismos proteína antifungica inibidores de cisteino protease genética molecular cistatina

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