Estudos funcionais de inibidores de cisteíno peptidases da cana-de-açúcar e caracterização de uma cisteíno peptidase de Sphenophorus levis, uma importante praga da cultura canavieira

AUTOR(ES)

Marcia Dellamano

DATA DE PUBLICAÇÃO

2009

RESUMO

Cistatinas são proteínas que inibem especificamente cisteíno peptidases. A canacistatina 1, uma proteína com 106 resíduos de aminoácidos, apresenta grande similaridade com a proteína Orizacistatina 1, uma cistatina de arroz. Com o objetivo de se obter uma cistatina com a atividade inibitória melhorada, experimentos de evolução molecular direta de proteínas foram realizados, através da construção de uma biblioteca de DNA shuffling usando estas duas cistatinas. Um clone denominado A10PL3 foi selecionado, expresso, purificado e submetido a ensaios de inibição de atividade enzimática. Foi demonstrado que a proteína A10PL3 exibiu aumento da atividade inibitória contra catepsina B humana em comparação com seus dois precursores. O presente estudo teve como objetivo reverter as alterações do clone A10PL3 através de mutações sítio-dirigidas, gerando mais três cistatinas mutantes: Mutante I (Thr17Ile), Mutante II (Gln 84 Leu) e Mutante III (Thr17Ile); (Gln84Leu). Ensaios de atividade inibitória dos mutantes contra as catepsinas humanas B e L foram realizados. Além disso, foram desenvolvidos estudos estruturais por meio de modelagem molecular de proteínas por homologia que permitiram a compreensão dos determinantes moleculares relacionados à melhoria da atividade inibitória destas cistatinas. Os resultados aqui apresentados são importantes, pois corroboram com os dados observados anteriormente, demonstrando a melhora na especificidade da atividade inibitória da proteína A10PL3 contra a catepsina B (Ki = 16 nM) em relação aos seus parentais. Os mutantes I, II e III não foram capazes de inibir a catepsina B. Os estudos estruturais revelaram que as mutações na cistatina A10PL3 desestabilizaram o núcleo hidrofóbico provavelmente tornando a região N-terminal da proteína mais flexível, influenciando a atividade inibitória contra a catepsina B. A desestabilização do núcleo hidrofóbico resultou na tendência de uma menor solubilidade, provavelmente devido à sua tendência de expor resíduos que fazem parte desse núcleo, o que pode levar à agregação e também contribuir para o aumento da flexibilidade da cistatina.

ASSUNTO(S)

cisteíno peptidase cana-deaçúcar dna shuffling sphenophorus levis modelagem molecular genetica biotecnologia

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